文献类型：期刊文章

作　　者：王彩虹[1] 柳英[2] 蔡秦真[1] 杨红枚[1] 马丽莎[1] 高基民[1]

Caihong Wang;Ying Liu;Qinzhen Cai;Hongmei Yang;Lisha Ma;Jimin Gao(Zhejiang Provincial Key Laboratory for Technology & Application of Model Organisms, School of Laboratory Medicine, School of Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou Zhejiang;Yantai Central Hospital of Longkou Mining, Yantai Shandong)

机构地区：[1]温州医科大学检验医学院、生命科学学院浙江省模式生物技术与应用重点实验室,浙江温州 [2]烟台市龙口矿务局中心医院ICU,山东烟台

出　　处：《免疫学研究》

基　　金：国家新药创新重大专项(No.2009ZX09103-649);浙江省重大科技专项(Nos.2008C14082,2010C13007);卫生部科研基金(No.201231029);浙江省教育厅科学基金(No.Y201016528);浙江省卫生高层次创新人才培养工程;浙江省研究生创新科研项目。

年　　份：2015

卷　　号：3

期　　号：1

起止页码：1-11

语　　种：中文

收录情况：普通刊

摘　　要：构建了人肿瘤坏死因子受体II胞外区、人脂联素球部与人IgG1 Fc的融合基因sTNFRII-gAD-Fc的真核表达载体,在CHO-S细胞中快速高效表达,探索了无血清悬浮流加培养工艺。应用重组PCR将人IgG1 Fc基因片段与sTNFRII-gAD基因片段融合,构建pMH3-sTNFRII-gAD-Fc表达载体,电转染至CHO-S细胞,挑选G418抗性的高表达单克隆,斑点杂交半定量分析和Western blot分析sTNFRII-gAD-Fc的表达,Protein A-Agarose纯化,以及拮抗TNFα的生物活性测定。最后在摇瓶、转瓶及生物反应器中进行了逐级放大的无血清悬浮批次及流加培养,即:2.0 ×106 cells/mL的接种密度,当达到4.0 ×106 cells/mL以上时开始流加培养并以每日葡萄糖的残余量2 g/L左右作为流加体积的控制参数。成功构建pMH3- sTNFRII-gAD-Fc表达载体,检测到sTNFRII-gAD-Fc在CHO-S细胞培养上清中以二聚体和多聚体形式表达,获得了高表达(75 μg/mL)单克隆细胞株,且该蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性。在摇瓶中无血清批次培养和转瓶及生物反应器中流加培养时产量分别为10.0 mg/L、18.3 mg/L和20.5 mg/L。利用CHO-S细胞系统成功实现了sTNFRII-gAD-Fc 融合蛋白的快速高效表达,为建立一套高密度、高效表达该融合蛋白的悬浮流加培养中试工艺打下了良好基础。

关 键 词：可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部  人免疫球蛋白G1  Fc  TNF拮抗剂  “富含GC”表达体系  悬浮流加培养  

分 类 号：Q7]