文献类型：期刊文章

作　　者：孙自勇[1] 陈均勇[1] 陈新园[1] 汪晶[1] 田鹏鹏[1] 吴盛[1] 刘建宁[1]

机构地区：[1]南京大学分子医学研究所,南京210093

出　　处：《南京大学学报（自然科学版）》

基　　金：国家重大科技专项"创新药物和中药现代化"(2002AA2Z3451)

年　　份：2004

卷　　号：40

期　　号：1

起止页码：41-48

语　　种：中文

收录情况：AJ、BDHX、BDHX2000、CAS、CSCD、CSCD2011_2012、JST、MR、RCCSE、ZGKJHX、ZMATH、核心刊

摘　　要：　用RT＿PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,EnterokinaseLightChain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichiapastorisGS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn＿Sepharose亲和层析一步纯化,从每升培养液可获得1.6mgEKLC,其纯度达90%以上.酶反应动力学结果表明,EKLC对小分子底物Gly＿Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿β＿naphthylamide的Km为(753±42)mol/L,kcat为(31.5±3.8)s-1.对硫氧化还原蛋白-脑钠素融合蛋白(Trx＿hBNP)的酶解作用显示,当酶与底物重量比大于1∶100时,经37℃保温5h后,超过75%的融合蛋白被裂解.上述结果表明,EKLC能够特异识别并水解Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿肽键,是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.

关 键 词：肠激酶 毕赤酵母 分泌表达 纯化 酶切  免疫印迹 丝氨酸蛋白水解酶  

分 类 号：Q556] Q78