文献类型：期刊文章

作　　者：鲍张杰[1] 陈向东[1] 汪辉[1] 任聪[1] 练家惠[1]

BAO Zhang-jie;CHEN Xiang-dong;WANG Hui;REN Cong;LIAN Jia-hui(Department of Microbiology,School of Life Science and Technology,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China)

机构地区：[1]中国药科大学生命科学与技术学院微生物学教研室

出　　处：《药物生物技术》

基　　金：江苏高校优势学科建设工程资助项目(No.PPZY2015A057)

年　　份：2019

卷　　号：26

期　　号：2

起止页码：95-99

语　　种：中文

收录情况：CAS、CSA、CSA-PROQEUST、EMBASE、IC、SCOPUS、ZGKJHX、普通刊

摘　　要：VD3羟化酶(VD3Hydroxylase,VDH)是一种P450单加氧酶,属于CYP107家族,能够催化维生素D3的25位羟基化。铁氧化还原蛋白(Ferredoxin,FDX)和铁氧化还原蛋白还原酶(Ferredoxin reductase,FDR)是两个电子传递链蛋白,参与羟化反应中电子的传递。构建具有羟基化酶体系活性的重组大肠杆菌,为骨化醇类化合物的高效转化提供参考。分别构建重组质粒p ETDuet-1-fdr-fdx及p ACYCDuet-1-vdh,将两个相容性质粒同时转入大肠杆菌BL21(DE3)中。采用IPTG对重组大肠杆菌进行诱导,使其表达目的蛋白,利用SDS-PAGE检测其蛋白大小及可溶性。采用液体传代的方法研究质粒稳定性。酶切鉴定和测序证明重组质粒p ETDuet-1-fdr-fdx及p ACYCDuet-1-vdh构建成功。SDS-PAGE结果显示目的蛋白大小与预期一致。重组大肠杆菌可以将阿法骨化醇和艾地骨化醇中间体(AD-M07)分别转化成骨化三醇和艾地骨化醇中间体(AD-M08),转化率分别为36. 10%和22. 87%,转化时间为12 h,比自养假诺卡氏菌缩短600%。重组大肠杆菌经传代50次,质粒稳定性达到92%以上,说明该重组大肠杆菌菌株稳定性较好。实验成功构建了具有羟基化酶体系活性的重组大肠杆菌,为高效转化阿法骨化醇和艾地骨化醇中间体(AD-M07)奠定了基础。

关 键 词：羟基化作用  生物转化 相容性质粒  重组大肠杆菌 表达  稳定性  

分 类 号：Q78] R914]