文献类型：期刊文章

作　　者：徐宏[1] 罗思凡[2] 罗思琛[2] 周颖欣[2] 谷夏斐[2] 康海仙[2]

XU Hong;LUO Si-fan;LUO Si-chen;ZHOU Ying-xin;GU Xia-fei;KANG Hai-xian(Department of Pharmacy,Longhua District People's Hospital,Shenzhen 518109,China;Department of Biotechnology,College of Basic Medicine,Guangdong Medical University,Dongguan 523808,China)

机构地区：[1]深圳市龙华区人民医院药学部,广东深圳518109 [2]广东医科大学基础医学院生物技术系,广东东莞523808

出　　处：《生物技术》

基　　金：国家自然科学基金项目(81572566);广东省医学科研基金项目(2015346)

年　　份：2019

卷　　号：0

期　　号：4

起止页码：361-366

语　　种：中文

收录情况：CAS、JST、ZGKJHX、普通刊

摘　　要：[目的]探索应用pIRES2-EGFP表达载体快速建立Hela细胞稳转细胞系的筛选方法。[方法]EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切,T4 DNA连接酶连接构建目的基因p IRES2-EGFP表达载体并测序确定,Lipofectamine3000转染Hela细胞分为Mock组(未转染组)、NC组(p IRES2-EGFP空载对照组)、重组质粒转染组,转染后24 h消化细胞进行初步筛选(900μg/m LG418),转染后14~16 d将长至肉眼可见的细胞克隆全部重新消化进行二次筛选(方法同初步筛选),转染后28~32 d挑选3个肉眼可见的细胞克隆,实时荧光定量PCR和WB检测目的基因过表达效率。[结果]双酶切及测序确定重组质粒成功构建,与Mock组相比,NC组无明显变化,重组质粒转染组各克隆目的基因mRNA水平分别升高109±8. 3、127±10. 5、122±9. 1倍,P <0. 01,蛋白水平分别升高33±3. 3、45±4. 7、47±4. 9倍,P <0. 01。[结论]该筛选方法 28~32d左右可快速建立Hela细胞稳转细胞系,过表达效率高,可直接进行后续实验。

关 键 词：pIRES2-EGFP载体  快速构建  HELA细胞 稳转细胞系  

分 类 号：Q78]