文献类型：期刊文章

作　　者：何佳佳[1] 陈耀[2] 曹淳[2] 鞠小丽[1] 周小明[1]

He Jiajia;Chen Yao;Cao Chun(Medical School,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;InnoZyme Biotech Co.Ltd.,Nanjing 211800,China)

机构地区：[1]江苏大学医学院基础医学系,镇江212013 [2]依诺赞(江苏)生物科技有限公司,南京211800

出　　处：《华中科技大学学报(医学版)》

基　　金：国家自然科学基金资助项目(No.81571546)。

年　　份：2025

卷　　号：54

期　　号：2

起止页码：151-158

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2023、核心刊

摘　　要：目的建立简便的doggybone DNA(dbDNA)制备技术路线,探讨dbDNA与传统质粒DNA基因表达与诱导免疫反应的差异;利用dbDNA诱导人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)重编程为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC);探索在iPSC AAVS1位点插入超长DNA片段的方案,并同时将Cas9表达框定点插入dbDNA来源的iPSC腺相关病毒位点1(adeno-associated virus site 1,AAVS1)安全港内,构建仅需输入目的基因靶向单向导RNA(single guide RNA,sgRNA)即可实现iPSC基因编辑的稳定细胞株。方法利用Phi29 DNA聚合酶多重置换扩增、原核端粒酶TelN酶切及共价连接、限制性内切酶和外切酶去除骨架环,从而建立简便的dbDNA制备技术路线,将dbDNA-GFP载体与pMax-dbDNA-GFP传统质粒载体分别电转至PBMC,检测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达效率,利用qPCR检测两组细胞干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的mRNA表达水平;制备dbDNA重编程载体dbDNA-MOS、dbDNA-KLF4、dbDNA-MYC及dbDNA-BCL并核转PBMC诱导重编程,通过形态学、碱性磷酸酶染色、RT-PCR以及干细胞多能性标志物检测来鉴定dbDNA-iPSC细胞系;在iPSC AAVS1位点利用ZFN与TALEN基因编辑技术插入11.5 kb的含有Cas9表达框、序列中引入终止密码子的EGFP读码框、真核细胞筛选标记等元件的超长DNA片段,通过红色荧光检测、基因组PCR反应以及Western blot等方法鉴定Cas9整合入AAVS1位点的iPSC细胞株,将EGFP单链同源修复模板与EGFP sgRNA共转染阳性iPSC细胞株,靶向修复EGFP基因中错误终止密码子,正确表达绿色荧光蛋白,从而验证Cas9蛋白的基因编辑能力。结果成功制备dbDNA载体并利用其实现基因表达,dbDNA表达GFP基因效率与传统质粒DNA表达效率相近,IFN-γ的mRNA表达水平dbDNA组小于传统质粒DNA组;成功获取形态似人胚胎干细胞,碱性磷酸酶染色、多能性相关基因表达及干细胞多能性标志物阳性的iPSC细胞

关 键 词：诱导性多能干细胞 dbDNA  CRISPR-Cas9  腺相关病毒位点1  

分 类 号：Q78]