文献类型：期刊文章

作　　者：杨花[1] 刘孜斐[1] 吕文莉[1] 王锋[1] 张艳丽[1]

YANG Hua;LIU Zifei;LÜWenli;WANG Feng;ZHANG Yanli(Institute of Sheep and Goat Science,College of Animal Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,Jiangsu,China)

机构地区：[1]南京农业大学动物科技学院羊业科学研究所,江苏南京210095

出　　处：《生物工程学报》

基　　金：国家自然科学基金(31872359)。

年　　份：2023

卷　　号：39

期　　号：10

起止页码：4219-4233

语　　种：中文

收录情况：AJ、BDHX、BDHX2020、CAS、CSCD、CSCD2023_2024、EAPJ、EBSCO、EMBASE、IC、JST、PUBMED、RCCSE、SCOPUS、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：本研究旨在探索VASA基因在绵羊睾丸发育中的表达变化,并通过构建VASA基因敲入载体,为下一步进行绵羊生殖细胞体外诱导分化研究提供基础。采集性成熟前后即3月龄(3-month-old,3M)和9月龄(9-month-old,9M)绵羊睾丸组织,利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和Western blotting技术分析VASA基因的差异表达,并利用免疫组织化学技术对VASA基因的表达定位进行分析。设计靶向VASA基因的向导RNA(guide RNA,gRNA),并构建同源重组载体,进行质粒转染绵羊耳成纤维细胞。结合CRISPR/dCas9技术对VASA基因进行激活,进一步验证载体效率。结果表明,VASA基因随着绵羊睾丸发育,表达水平极显著增加(P<0.01),且主要定位在精母细胞和圆形精子细胞中。利用CRISPR/Cas9系统构建了VASA基因敲入载体,联合pEGFP-PGKpuro-VASA载体转染耳成纤维细胞,CRISPR/dCas9系统激活后,耳成纤维细胞成功表达VASA基因。结果提示,VASA基因在绵羊睾丸发育和精子发生中发挥潜在功能,且通过CRISPR/Cas9系统可在体外构建VASA基因敲入载体,为下一步探究VASA基因对绵羊雄性生殖细胞的发育和分化提供有效的研究手段。

关 键 词：VASA CRISPR/Cas9  CRISPR/dCas9  敲入  绵羊

分 类 号：S826]