文献类型：期刊文章

作　　者：皇甫皓月[1] 雷薪霖[2] 席飞[1] 黄炼榆[1] 王可欣[1] 沈冬冬[1] 张纪文[1] 张振江[1] 李芳[1] 步志高[1] 殷昊[2] 赵东明[1]

HUANG FU Hao-yue;LEI Xin-lin;XI Fei;HUANG Lian-yu;WANG Ke-xin;SHEN Dong-dong;ZHANG Ji-wen;ZHANG Zhen-jiang;LI Fang;BU Zhi-gao;YIN Hao;ZHAO Dong-ming(State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069,China;Institute of Medical Sciences,Wuhan University,Wuhan 430071,China)

机构地区：[1]中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室,黑龙江哈尔滨150069 [2]武汉大学医学研究院,湖北武汉430071

出　　处：《中国预防兽医学报》

基　　金：兽医生物技术国家重点实验室自主课题(SKLVBP202101)。

年　　份：2023

卷　　号：45

期　　号：5

起止页码：452-458

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2020、CAB、CAS、CSCD、CSCD_E2023_2024、IC、JST、RCCSE、WOS、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：有报道证实,缺失重要功能基因EP152R的非洲猪瘟病毒(ASFV)不能有效复制。为了筛选靶向ASFV EP152R基因的小向导RNA(sgRNA),分析EP152R基因对ASFV复制的影响,本研究利用簇状规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR-Cas9)核酸酶系统(CCTop)并利用猪的基因组作为脱靶对象设计并筛选靶向ASFV EP152R基因(72387nt~72845nt)的sg RNA,并采用非随机整合报告系统(TIDE)计算各对sg RNA的编辑效率确定最佳sg RNA。结果显示,筛选了5对靶向敲除ASFV EP152R基因的sg RNA,其中3对sg RNA对EP152R基因的编辑效率达30%~42%,另外两对sg RNA的编辑效率低于10%。将筛选的3对sg RNA退火后分别克隆至p-LentiCRISPRv2载体中,构建3个重组慢病毒质粒p-LentiCRISPRv2-gREP152R-1/2/3,并采用菌液PCR及测序鉴定正确后分别与2个辅助质粒共转染HEK293T细胞,72 h后获得各慢病毒并分别感染野猪肺细胞(WSL细胞),通过嘌呤霉素筛选表达各sg RNA的细胞WSL-g REP152R,并采用western blot鉴定。结果显示,构建的各细胞在40 ku处均出现特异性条带,而WSL细胞无该条带,表明正确构建表达3种EP152R sg RNA的细胞系WSL-g REP152R-1/2/3。将携带m Cherry报告基因的重组ASFV(mCherry-ASFV)以MOI 1感染各WSL-g REP152R细胞系,分别于不同时间观察荧光;收集各细胞上清液,采用荧光定量PCR(qPCR)检测ASFV P72基因的Ct值,并测定上清液中的病毒效价(感染后72 h)。观察结果显示,随感染时间的延长WSL-g REP152R-2/3中的红色荧光均明显减少;WSL-g REP152R-1及空白对照WSL细胞中的红色荧光则逐渐增多,但前者的红色荧光均少于后者。q PCR和TCID50测定结果显示,与空白对照WSL细胞相比,3种WSL-g REP152R细胞上清液中病毒扩增的Ct值均显著或极显著升高(P<0.05、P<0.01),而病毒效价均显著或极显著降低(P<0.05、P<0.01),且以WSL-g REP152R-2中的病毒效价最低。将m Cherry-ASFV感染各WSLg REP152R细胞并连续传3代,采用q PCR检测F2

关 键 词：非洲猪瘟病毒 簇状规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9  EP152R  g RNA  

分 类 号：S852.65]