文献类型：期刊文章

作　　者：孟瀚哲[1,2] 何维志[2] 胡璐璐[1,2]

MENG Han-zhe;HE Wei-zhi;HU Lu-u(Institutes of Biomedical Sciences,Fudan University,Shanghai 200032,China.;Fudan University Shanghai Cancer Institute,Shanghai 200032,China)

机构地区：[1]复旦大学生物医学研究院,上海200032 [2]复旦大学肿瘤研究所,上海200032

出　　处：《复旦学报（医学版）》

基　　金：国家重点研发计划(2021YFA1100400)。

年　　份：2023

卷　　号：50

期　　号：3

起止页码：439-446

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2020、CAS、CSCD、CSCD2023_2024、IC、JST、RCCSE、SCOPUS、WOS、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：目的建立m6A特异性烯丙基标记测序(m6A-selective allyl chemical labeling and sequencing,m6A-SAC-seq)实验方法体系,在单核苷酸分辨率水平对RNA的N6-甲基腺苷(m6A)修饰进行检测。方法m6A烯丙基标记测序(m6A-SAC-seq)使用特异性甲基转移酶MjDim1对m6A添加烯丙基标记成为N6-烯丙基-甲基腺苷(am6A),使用I2处理产生N1,N6-环化腺苷(A)产物,在逆转录时引入突变,从而实现在单核苷酸分辨率水平的检测。通过HPLC法纯化甲基转移酶MjDim1,使用探针及液相色谱-质谱联用系统(LC-MS/MS)检测m6A的转换率,计算MjDim1活性作为质控。提取样品RNA,用烯丙基标记m6A,并用m6A-SAC-seq技术构建文库,测序后通过数据分析得到m6A位点信息,通过标准曲线校准计算得到m6A的含量。结果m6A-SAC-seq处理后,HIV逆转录酶识别环化的am6A位点,引入突变,但附近未修饰位点不发生突变。通过特定的A突变成T/C的突变位置(A to T/C)来识别m6A位点,并添加内参探针,用标准曲线来定量m6A含量。结论m6A-SAC-seq技术仅需30 ng的mRNA或去除了rRNA的总RNA样本就可以实现m6A位点在单核苷酸分辨率水平的检测。

关 键 词：RNA甲基化  m6A甲基化  单核苷酸分辨率  m6A-SAC-seq  测序方法

分 类 号：Q3-3]