文献类型：期刊文章

作　　者：王国桧[1] 谢志鹏[1,2] 张建国[3]

WANG Guohui;XIE Zhipeng;ZHANG Jianguo(Institute of Pharmaceutical Biotechnology&School of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310058,Zhejiang,China;Zhejiang Provincial Key Laboratory for Microbial Biochemistry and Metabolic Engineering,Hangzhou 310058,Zhejiang,China;Hangzhou Bioking Biochemical Engineering Limited Company,Hangzhou 311106,Zhejiang,China)

机构地区：[1]浙江大学药物生物技术研究所&医学院,浙江杭州310058 [2]浙江省微生物生化与代谢工程重点实验室,浙江杭州310058 [3]杭州宝晶生物股份有限公司,浙江杭州311106

出　　处：《微生物学通报》

年　　份：2023

卷　　号：50

期　　号：5

起止页码：1741-1755

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2020、CAS、CSCD、CSCD2023_2024、IC、JST、RCCSE、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：【背景】D(-)-酒石酸是非天然有机酸,在保健品、食品和肿瘤药物合成等行业具有重大应用潜力,目前主要通过生物转化法生产,即顺式环氧琥珀酸水解酶[cis-epoxysuccinic acid hydrolase,CESH(D)]水解顺式环氧琥珀酸(cis-epoxysuccinic acid,ESH)生成D(-)-酒石酸。该法简单温和,但存在CESH(D)酶活转化效率低下的瓶颈问题。【目的】通过基因工程改造,提高CESH(D)的酶活力、温度和pH稳定性。【方法】利用定向进化和半理性设计体外改造CESH(D),高通量筛选出正向突变体;然后对其进行酶学性质研究,包括比酶活、温度和pH对酶催化效率的影响、酶的温度稳定性、pH稳定性及酶促动力学分析;最后通过分子对接等手段分析突变位点影响催化活性的初步机制。【结果】筛选获得4个正向突变体L231P/N226S、V77I、D183E和T223S。与野生型相比,4个突变体的比酶活分别提高2.2、1.6、1.5和1.4倍。其中,L231P/N226S的温度稳定性和pH稳定性较野生型均有显著提高,55℃时催化活性为野生型的1.6倍,pH 6.0时催化活性为野生型的1.2倍。动力学分析发现,突变体L231P/N226S和T223S对底物ESH的亲和力有明显提升,Km值分别为20 mmol/L和21 mmol/L,较野生型分别降低18%和16%。分子对接研究表明,突变位点主要通过改变底物结合口袋促进酶与底物的相互作用,从而影响酶活。【结论】获得了温度和pH稳定性好、催化活性明显提高的CESH(D)突变体,初步分析突变位点影响酶活的机制,为进一步研究CESH(D)的结构-功能关系及深入改造提供指导。

关 键 词：顺式环氧琥珀酸水解酶 D(-)-酒石酸  定向进化 半理性设计  

分 类 号：Q814[生物工程类]