文献类型：期刊文章

作　　者：李爱涛[1] 汪倩[1] 宋希彤[2] 张小栋[1] 黄建文[1] 陈纯琪[1] 郭瑞庭[1] 王斌举[2] Manfred T.Reetz[3,4]

Aitao Li;Qian Wang;Xitong Song;Xiaodong Zhang;Jian‐Wen Huang;Chun‐Chi Chen;Rey‐Ting Guo;Binju Wang;Manfred T.Reetz(Dedicated to Prof.Karl-Erich Jaeger on the occasion of his retirement.a State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering,Hubei Hongshan Laboratory,Hubei Key Laboratory of Industrial Biotechnology,School of life science,Hubei University,Wuhan 430062,Hubei,China;State Key Laboratory of Physical Chemistry of Solid Sur‐faces and Fujian Provincial Key Laboratory of Theoretical and Computational Chemistry,College of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen University,Xiamen 360015,Fujian,China;Max‐Planck‐Institut für Kohlenforschung,45470 Muelheim,Germany;Tianjin Institute of Industrial Biotechnology,Chinese Academy of Sciences,Tianjin 300308,China)

机构地区：[1]湖北大学生命科学学院,工业生物技术湖北省重点实验室,省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室,湖北武汉430062 [2]厦门大学化学化工学院,理论与计算化学福建省重点实验室,固体表面物理化学国家重点实验室,福建厦门360015 [3]马克斯.普朗克煤炭研究所,德国慕尼黑 [4]中国科学院天津工业生物技术研究所,天津300308

出　　处：《Chinese Journal of Catalysis》

基　　金：国家重点研发计划(2019YFA0906400);湖北省生物催化与酶工程技术引智创新示范基地项目(2019BJH021);湖北省自然科学基金创新团体项目(2020CFA011);省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室自主研发项目.

年　　份：2023

卷　　号：47

期　　号：4

起止页码：191-199

语　　种：中文

收录情况：AJ、CAS、CSCD、CSCD2023_2024、EAPJ、EBSCO、EI、IC、JST、RCCSE、SCIE、SCOPUS、WOS、ZGKJHX、普通刊

摘　　要：传统的Kemp消除反应可以通过氢氧化钾和三烷基胺等碱性物质,催化底物苯并异恶唑开环生成产物2-氰基苯酚.三十年来,Kemp消除反应一直被用作模式反应来设计或定向进化新型生物酶催化剂,从而揭示未知的酶催化机制的复杂性,增强对酶催化机制的理解.目前科研人员使用不同的蛋白作为骨架设计能够高效催化Kemp消除反应的人工酶.例如Hilvert及Mayo等基于人工酶HG3.17,设计获得了Kemp消除酶,可以催化5-硝基苯并异恶唑生成产物2-氰基-4-硝基苯酚.通过17轮定向进化获得的最终突变体展现出与天然酶相近的催化活性(k_(cat)/Km=230000 L mol^(-1)s^(-1);k_(cat)=700 s^(-1)).该研究不仅表明蛋白质工程可以进化出高效的生物酶,量子力学/分子力学(QM/MM)分析还揭示了突变体催化活性提高的分子机制.与酸碱催化的Kemp消除反应不同,最近Korendovych等报道以肌红蛋白作为骨架基于氧化还原机制的Kemp消除反应,通过开发一种独特的基于核磁共振(NMR)的蛋白质定向进化技术,快速鉴定出热点氨基酸位点并获得了高催化活性的人工酶突变体,其同样达到了天然酶的催化活性.此前我们研究(Nat.Commun.,2017,8,14876)发现,与传统的酸碱催化机制完全不同,细胞色素P450-BM3能够通过氧化还原的机制催化Kemp消除反应.本文继续以P450-BM3为蛋白骨架,对其进一步改进以提高催化活性.以P450-BM3突变体F87G(kcat=3.0s^(-1))为模板,借助双密码子(酪氨酸和赖氨酸,Y-K)饱和突变策略,对其活性中心的六个关键氨基酸位点进行组合突变,经过筛选获得了活性大幅度提高的三突变体F87G/L75Y/T438K(k_(cat)=27.4s^(-1)).为进一步解析其催化活性提高的分子机制,首先对该突变体与底物复合物的晶体结构进行了解析,结果发现底物在突变体活性口袋的构象与野生型P450-BM3完全不同,底物的硝基指向了Heme辅基.对其进行了QM/MM计算研究,发现Heme-Fe

关 键 词：Kemp消除反应  氧化还原机理  P450单加氧酶  量子力学/分子力学  X射线结构  饱和突变  

分 类 号：O625.6] TQ426.97[化学类]