文献类型：期刊文章

作　　者：张艺[1] 吴道秋[1] 汤弘婷[1] 李梦醒[2] 刘虹麟[3] 陈忠良[4] 李琴山[1,5]

Zhang Yi;Wu Daoqiu;Tang Hongting;Li Mengxing;Liu Honglin;Chen Zhongliang;Li Qinshan(Department of Clinical Biochemistry,School of Medical Laboratory Science,Guizhou Medical University,Guiyang 550004,Guizhou Province,China;Department of Hematology,Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang 550004,Guizhou Province,China;Institute of Clinical Medical Sciences,China-Japan Friendship Hospital,Beijing 100000,China;Tissue Engineering and Stem Cell Experimental Center,Guizhou Medical University,Guiyang 550004,Guizhou Province,China;Guizhou Provincial Prenatal Diagnosis Center,Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang 550004,Guizhou Province,China)

机构地区：[1]贵州医科大学医学检验学院临床生物化学教研室,贵州省贵阳市550004 [2]贵州医科大学附属医院血液科,贵州省贵阳市550004 [3]北京中日友好医院临床医学研究所,北京市100000 [4]贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心,贵州省贵阳市550004 [5]贵州医科大学附属医院贵州省产前诊断中心,贵州省贵阳市550004

出　　处：《中国组织工程研究》

基　　金：国家自然科学基金(81960476,81460365),项目负责人:李琴山;国家自然科学基金(81760039),项目负责人:李梦醒;国家自然科学基金(81402451,82173378),项目负责人:刘虹麟;贵州省科技厅资助项目([2019]1270),项目负责人:李琴山;贵州省科技厅资助项目([2020]4Y160),项目负责人:李梦醒;贵州省卫生健康委基金(gzwkj2021-160),项目负责人:李梦醒。

年　　份：2023

卷　　号：27

期　　号：24

起止页码：3838-3844

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2020、CAS、EMBASE、JST、RCCSE、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：背景:研究报道敲低MKRN1可以抑制肿瘤细胞的生长,但MKRN1是否作为肿瘤相关蛋白在机体发挥作用还需进一步研究。由于siRNA介导的基因沉默是瞬时表达,持续时间短且常规慢病毒技术存在脱靶效应,利用四环素调控(Tet-on)慢病毒系统构建稳定沉默MKRN1基因的细胞系有着可逆的优势,且可规避上述缺点,对于深入研究MKRN1的生物学功能有重要的意义。目的:构建Tet-on慢病毒系统介导的MKRN1基因沉默载体,研究沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖、凋亡的影响。方法:采用RNAi技术,针对MKRN1基因设计3条shRNA(命名为sh1,sh2,sh3),将3条shRNA序列连入四环素诱导表达载体pTripz中验证连入序列;通过三质粒系统转染HEK-293T细胞,并用含有1 mg/L强力霉素的完全培养基培养,进行慢病毒包装,收取48 h及72 h病毒液,将其浓缩后感染HEK-293T细胞,感染48 h后用荧光显微镜观察病毒感染效率。通过实时荧光定量PCR、Western blot检测MKRN1的敲减效率;Western blot检测四环素诱导表达系统是否构建成功;通过集落形成实验及Western blot检测沉默MKRN1表达后对HEK-293T细胞增殖、凋亡能力的影响。结果与结论:(1)设计的3条MKRN1-短发夹RNA(sh1、sh2、sh3),均成功连入Tet-on载体,且各组载体序列正确;通过慢病毒成功感染HEK-293T细胞;(2)实时荧光定量PCR及Western blot检测发现3条shRNA序列中1号序列敲低MKRN1水平明显降低(P<0.05),且沉默组不加入强力霉素诱导后目的基因的表达得到回复;(3)集落形成实验发现沉默MKRN1后HEK-293T细胞增殖能力下降(P<0.05);Western blot检测敲低MKRN1后,增殖细胞核抗原表达下调,细胞凋亡相关指标BAX表达增加,Bcl2表达下调,Bcl2/BAX的比值下调(P<0.001);(4)结论:采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞株,且沉默MKRN1后能够抑制HEK-293T细胞的增殖,并促进其凋亡。通过构建稳定沉默MKRN1的HEK-293T�

关 键 词：MKRN1基因  四环素诱导调控表达系统  基因表达调控 慢病毒

分 类 号：R446] R318[临床医学类] R496