文献类型：期刊文章

作　　者：焦凤娟[1] 刘俊杰[1] 卢思维[1] 姜东君[1]

JIAO Fengjuan;LIU Junjie;LU Siwei;JIANG Dongjun(Shandong Key Laboratory of Behavioral Medicine,School of Mental Health,Jining Medical University,Jining 272067,China)

机构地区：[1]济宁医学院精神卫生学院山东省行为医学重点实验室,山东济宁272067

出　　处：《吉林大学学报（医学版）》

基　　金：国家自然科学基金青年基金项目(82101340)。

年　　份：2022

卷　　号：48

期　　号：5

起止页码：1109-1115

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2020、CAS、CSCD、CSCD_E2021_2022、EMBASE、IC、JST、RCCSE、SCOPUS、WOS、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：目的:基于重叠延伸PCR(SOE PCR)技术构建转录因子EB(TFEB)丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。方法:根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物F_(n)和R_(n)进行第1步PCR扩增,获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步PCR扩增获得含突变位点的目的DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用BamHⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果。于大肠杆菌(E.coli)中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。结果:第1步PCR扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步PCR退火延伸和第3步PCR扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。双酶切鉴定,连接的DNA片段与目的片段大小一致。DNA测序显示TFEB的114位丝氨酸(TCT)成功突变为丙氨酸(GCT)。在0.5 mmol·L^(-1)IPTG、16℃诱导过夜条件下获得TFEB及其突变体的可溶性蛋白表达。SDS-PAGE凝胶电泳,纯化后蛋白浓度较高,分子大小正确。结论:利用SOE PCR技术成功实现了TFEB丝氨酸114位点的定点突变,并且TFEB及其突变体基因在E.coli中成功表达。

关 键 词：转录因子EB  重叠延伸PCR 定点突变 融合蛋白 丝氨酸 丙氨酸

分 类 号：Q78]