文献类型：期刊文章

作　　者：张冯禧[1,2] 肖琦[2] 朱家平[1,2] 尹力鸿[1,2] 赵霞玲[1,2] 严明帅[1] 徐晋花[1] 温立斌[2] 牛家强[1] 何孔旺[2]

ZHANG FengXi;XIAO Qi;ZHU JiaPing;YIN LiHong;ZHAO XiaLing;YAN MingShuai;XU JinHua;WEN LiBin;NIU JiaQiang;HE KongWang(College of Animal Science,Tibet Agricultural and Animal Husbandry University/Provincial Key Laboratory of Tibet Plateau Animal Epidemic Disease Research,Linzhi 860000,Tibet;Institute of Veterinary Medicine,Jiangsu Agricultural Sciences&Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Nanjing 210014)

机构地区：[1]西藏农牧学院动物科学学院/西藏高原动物疫病研究自治区高校重点实验室,西藏林芝860000 [2]江苏省农业科学院兽医研究所/农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室,南京210014

出　　处：《中国农业科学》

基　　金：江苏现代农业(生猪)产业技术体系创新团队(JATS[2021]382)。

年　　份：2022

卷　　号：55

期　　号：16

起止页码：3256-3266

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2020、CAB、CAS、CSCD、CSCD2021_2022、EAPJ、GEOBASE、IC、JST、RCCSE、SCOPUS、WOS、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：【背景】非洲猪瘟(ASF)于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒(ASFV)特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验(iELISA)鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1:1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1:102400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91%,总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单�

关 键 词：非洲猪瘟病毒 P30蛋白  单克隆抗体 抗原表位 阻断ELISA

分 类 号：S852.651]