文献类型：期刊文章

作　　者：闫干干[1,2] 李东升[3] 戚海燕[1] 付正豪[1] 刘晓平[1] 张晶[3] 陈云雨[1,2]

YAN Gangan;LI Dongsheng;QI Haiyan;FU Zhenghao;LIU Xiaoping;ZHANG Jing;CHEN Yunyu(Institute for Drug Screening and Evaluation,Wannan Medical College,Wuhu 241002,Anhui,China;Anhui Provincial Engineering Laboratory for Screening and Reevaluation of Bioactive Compounds of Herbal Medicines in Southern Anhui,Wannan Medical College,Wuhu 241002,Anhui,China;Institute of Medicinal Biotechnology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100050,China)

机构地区：[1]皖南医学院药物筛选与评价研究所,安徽芜湖241002 [2]皖南医学院安徽省皖南地区植物药活性筛选与再评价工程实验室,安徽芜湖241002 [3]中国医学科学院-北京协和医学院医药生物技术研究所,北京100050

出　　处：《生物工程学报》

基　　金：国家自然科学基金(81370087,81703546);安徽省自然科学基金(1808085QH265);安徽省高等学校自然科学研究项目(KJ2019ZD30,KJ2021A0839,YJS20210549);皖南医学院大学生科研资助金(WK2021XS54);皖南医学院青年骨干人才项目(wyqnyx202104)。

年　　份：2022

卷　　号：38

期　　号：6

起止页码：2236-2249

语　　种：中文

收录情况：AJ、BDHX、BDHX2020、CAS、CSCD、CSCD2021_2022、EAPJ、EBSCO、EMBASE、IC、JST、PUBMED、RCCSE、SCOPUS、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理,以新冠病毒主蛋白酶(main protease, Mpro)为靶标,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,以期快速筛选新型Mpro小分子抑制剂。利用大肠杆菌原核表达与分离纯化高活性的Mpro,再以FRET法进行比活力测定。基于FRET原理,以7-甲氧基香豆素-4-乙酸(7-methoxycoumarin-4-acetic acid, MCA)与2,4-二硝基苯酚(2,4-dinitropheno, Dnp)标记的多肽作为Mpro水解底物,通过优化反应缓冲液、Mpro反应浓度、反应温度与时间及DMSO耐受浓度,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型进行苗头化合物的筛选。利用大肠杆菌实现了高活性Mpro的原核表达与分离纯化,且比活力不低于40 000 U/mg。通过一系列优化实验,使用0.4μmol/L Mpro与5μmol/L底物建立了Z′因子值为0.79的Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,且反应体系中含有的二硫苏糖醇(1,4-dithiothreitol,DTT)是影响FRET筛选模型可靠性的重要因素。通过对天然产物化合物库进行高通量筛选,发现白花丹素与银杏酸在体外对Mpro酶活性具有良好的抑制作用。本研究建立了基于FRET原理的Mpro小分子抑制剂高通量筛选模型,初步证实了白花丹素与银杏酸是一类新型苗头化合物,为抗新型冠状病毒药物先导化合物的筛选与发现奠定了基础。

关 键 词：新冠病毒  主蛋白酶抑制剂  荧光共振能量转移 高通量筛选 白花丹素 银杏酸

分 类 号：R965.1]