文献类型：期刊文章

作　　者：刘娟娟[1] 张妍[2] 赫卫清[1]

Juanjuan Liu;Yan Zhang;Weiqing He(CAMS Key Laboratory of Synthetic Biology for Drug Innovation,NHC Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics,Institute of Medicinal Biotechnology,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100050,China;Shenyang Tonglian Group Co.,Ltd.,Shenyang 110042,Liaoning,China)

机构地区：[1]中国医学科学院医药生物技术研究所卫健委抗生素生物工程重点实验室中国医学科学院药物合成生物学重点实验室,北京100050 [2]沈阳同联集团有限公司,辽宁沈阳110042

出　　处：《生物工程学报》

基　　金：国家自然科学基金(No.81773617);中国医学科学院创新工程项目(No.2017-I2M-1-012)资助。

年　　份：2021

卷　　号：37

期　　号：6

起止页码：2116-2126

语　　种：中文

收录情况：AJ、BDHX、BDHX2020、CAS、CSCD、CSCD2021_2022、EAPJ2020、EBSCO、EMBASE、IC、JST、PUBMED、RCCSE、SCOPUS、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：可利霉素(Carrimycin,CAM)是将异戊酰基转移酶基因(Isovaleryltransferase gene,ist)导入到螺旋链霉菌中产生的以异戊酰螺旋霉素(Isovalerylspiramycin,ISP)为主组分的抗生素。原工程菌中的ist基因与螺旋霉素(Spiramycin,SP)生物合成基因簇相距较远,且具有两种抗性基因,难以对其进行基因改造,因此需要构建新型CAM工程菌株。文中通过CRISPR-Cas9基因编辑系统靶向切割2个位点,将ist和其正调控基因acyB2通过同源重组插入到SP生物合成基因簇附近且不参与SP合成的orf54基因下游,获得2种无外源抗性基因插入的CAM产生菌54IA-1和54IA-2,经发酵产物检测发现54IA-2菌株中的ISP产量明显高于54IA-1菌株。通过实时定量PCR (Quantitative real-time PCR,qPCR)检测证实54IA-2菌株中ist和acyB2基因以及部分SP生物合成基因的表达量均高于54IA-1菌株。为进一步获得高产菌株,以54IA-2为出发菌株,利用核糖体工程的方法筛选利福平(Rifampicin,RFP)抗性菌株,在RFP浓度为40μg/mL的抗性菌株中,ISP的产量明显提高,最高可达842.9μg/mL,比原始菌株提高约6倍。对其中7株菌的rpoB基因进行测序分析,每株菌的第576位丝氨酸都突变为丙氨酸,在其他错义突变中产量最高的菌株RFP40-6-8在第424位的谷氨酰胺突变为亮氨酸。综上所述,本研究应用CRISPR-Cas9系统成功构建了无任何抗性标记的新型CAM工程菌株54IA-1和54IA-2,并通过核糖体工程技术筛选获得了新型CAM高产菌株RFP40-6-8,为CAM工程菌株的进一步优化改造奠定了基础。

关 键 词：可利霉素  4″-O-异戊酰基转移酶基因  CRISPR-Cas9系统  核糖体工程  

分 类 号：TQ465[化工与制药类] Q78]