文献类型：期刊文章

作　　者：原新博[1] 程婷婷[1] 惠小涵[1] 陈章玉[1] 王瑞红[2] 柯卫东[3] 郭宏波[1]

YUAN XinBo;CHENG TingTing;XI XiaoHan;CHEN ZhangYu;WANG RuiHong;KE WeiDong;GUO HongBo(College of Chemistry and Pharmacy,Northwest Agriculture and Forestry University/State Local Joint Research Center of TCM Fingerprint/Shaanxi Research Center of TCM Fingerprint and Natural Products Library,Yangling 712100,Shaanxi;College of Life Sciences Northwest Agriculture and Forestry University,Yangling 712100,Shaanxi;Institute of Vegetable,Wuhan Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430065)

机构地区：[1]西北农林科技大学化学与药学院/中药指纹图谱国家地方联合工程研究中心/陕西省中药指纹图谱与天然产物库研究中心,陕西杨凌712100 [2]西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100 [3]武汉市农业科学院蔬菜研究所,武汉430065

出　　处：《中国农业科学》

基　　金：国家重点研发计划(2016YFD0100204-29);国家杨凌农业高新技术产业示范区科技计划(2018SF-08)。

年　　份：2020

卷　　号：53

期　　号：18

起止页码：3777-3791

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2017、CAB、CAS、CSCD、CSCD2019_2020、GEOBASE、IC、JST、RCCSE、SCOPUS、WOS、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：【目的】以中国莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)的多酚氧化酶家族成员之一NnPPO1(GenBank:ADC92563.1)为研究对象,筛选、验证与其互作的蛋白,为深入研究莲藕PPO的分子作用机制、精准抑制其活性奠定基础。【方法】利用酵母双杂交(Y2H)技术,验证莲藕抗氧化酶是否与NnPPO1存在互作关系。通过转化酵母试验检测互作蛋白过氧化氢酶同工酶NnCAT1(GenBank:XP_010242894.1)的毒性和自激活活性。构建双分子荧光标记试验(BiFC)所用的35S-NnPPO1-SPYNER173、35S-NnCAT1-SPYCEM表达载体,通过农杆菌介导法,将重组质粒转化烟草,进一步验证NnPPO1与NnCAT1之间的互作关系。根据NnPPO1和NnCAT1的结构域截短蛋白,寻找互作关键结构域。利用PlantCARE分析NnPPO1与NnCAT1启动子相关作用元件,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析NnPPO1与NnCAT1在莲藕不同组织中的表达水平。采用同源重组的方法构建35S-NnCAT1-GFP融合蛋白表达载体,用于亚细胞定位分析。运用DNAMAN软件对NnCAT1序列和其他物种序列进行多序列比对。运用生物信息学网站对NnCAT1进行理化性质与结构分析。【结果】NnCAT1与NnPPO1存在蛋白互作,且NnCAT1蛋白无自激活作用,对酵母菌株也没有毒性。在细胞膜和细胞核上观察到黄色荧光信号,进一步证实NnPPO1与NnCAT1之间存在互作。NnPPO1的酪氨酸酶结构域在蛋白互作中发挥主要作用。NnPPO1与NnCAT1启动子序列上存在多种顺式调控元件,如光响应元件Box 4、GT1-motif、TCT-motif,逆境响应元件ARE以及激素响应元件CGTCA-motif、TGACG-motif等。NnPPO1与NnCAT1的表达模式基本相同,在各组织中均有表达,均在叶中表达量最高,在茎尖中表达量最低。亚细胞定位结果显示NnCAT1定位于细胞膜和细胞核中。莲藕NnCAT1的相对分子质量约为57.0 kD,理论等电点(PI)为6.93;该蛋白为同源四聚体亲水性蛋白质;无跨膜结构和信号肽,存在叶绿体转运肽,前21 aa为转运肽�

关 键 词：莲藕 NnPPO1  NnCAT1  蛋白互作  亚细胞定位 组织特异性表达

分 类 号：S645.1]