文献类型：期刊文章

作　　者：王晗月[1,2] 李富荣[2] 杨晓菲[1,2] 胡巢凤[1]

Wang Hanyue;Li Furong;Yang Xiaofei;Hu Chaofeng(Department of Pathology and Pathophysiology,School of Medicine,Jinan University,Guangzhou 510632,Guangdong Province,China;Translational Medicine Collaborative Innovation Center,Second Clinical Medical College(Shenzhen People’s Hospital)of Jinan University,Shenzhen 518020,Guangdong Province,China)

机构地区：[1]暨南大学基础医学院病理生理学系,广东省广州市510632 [2]暨南大学第二临床医学院(深圳市人民医院)转化医学协同创新中心,广东省深圳市518020

出　　处：《中国组织工程研究》

基　　金：国家自然科学青年基金(81800685),项目负责人:杨晓菲;国家自然科学基金(81670702),项目负责人:李富荣;广东省自然科学基金项目(2018A030310039),项目负责人:杨晓菲;深圳市科创委基础研究自由探索项目(JCYJ20170307100154602),项目负责人:杨晓菲。

年　　份：2021

卷　　号：25

期　　号：7

起止页码：1056-1063

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2020、CAS、EMBASE、JST、RCCSE、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：背景:胰岛细胞移植是治疗糖尿病最有效的方法之一,然而移植细胞来源短缺限制了其临床应用。在体外进行肝细胞向胰岛β细胞的直接重编程是解决该问题的一个新思路,但肝细胞向胰岛β细胞分化是一个复杂的过程。目的:利用构建的CRISPR/dCas9-Pumilio系统(Casilio系统),通过改造向导RNA序列,与转录激活子PUFa-P65-HSF1结合,实现高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞。方法:采用脂质体转染法将Casilio体系(PNM)转染至HEK293T细胞系,靶向激活肝细胞内源PNM(Pdx1,Ngn3及MafA)基因,利用实时荧光定量PCR及免疫荧光检测内源PNM的表达。利用携带Ins-promoter-EGFP的慢病毒构建增强型绿色荧光蛋白稳定表达的Ins-EGFP HepG2细胞系,PiggyBac(PB)转座系统在此细胞系中构建核酸内切酶失活的Cas9(dCas9)和PUFa-P65-HSF1稳定表达的稳转细胞系。用脂质体向稳转细胞系分别转染针对PNM的向导RNA,然后实时荧光定量PCR和免疫荧光检测内源基因PNM的表达水平,并观察重编程效率。结果与结论:①实验在293T细胞系中验证了Casilio体系对内源基因的激活作用;②RT-PCR、Western Blot及免疫荧光检测验证了稳转细胞系中EGFP、dCas9和PUFa-P65-HSF1的表达;③实时荧光定量PCR证实靶向激活PNM的新型Casilio体系可实现内源PNM基因表达明显上调,直接重编程效率为10%-15%;④上述数据说明基于CRISPR/dCas9的新型Casilio体系,可成功激活肝脏内源PNM基因,可初步实现肝细胞系直接重编程为胰岛样细胞。

关 键 词：体细胞 胰岛样细胞 肝  细胞基因转染  糖尿病  CRISPR/dCas9  因子  蛋白  通路  

分 类 号：R459.9] R363[临床医学类]