文献类型：期刊文章

作　　者：董媛[1] 李建华[1] 贾俊臻[1] 冯文卓[1] 孟晨阳[1] 贺佳美[1] 唐一鑫[1] 王会岩[1]

DONG Yuan;LI Jianhua;JIA Junzhen;FENG Wenzhuo;MENG Chenyang;HE Jiamei;TANG Yixin;WANG Huiyan(Department of Biotechnology,Academy of Laboratory,School of Medical Laboratory,Jilin Medical University,Jilin 132013,China)

机构地区：[1]吉林医药学院检验学院生物技术教研室,吉林吉林132013

出　　处：《吉林大学学报（医学版）》

基　　金：吉林省教育厅科研项目资助课题(JJKH20180822KJ);吉林省科技厅科研项目资助课题(20180623045TC);吉林省中医药管理局科研项目资助课题(2018125);吉林省大学生创新创业训练项目资助课题(201813743007)。

年　　份：2020

卷　　号：46

期　　号：4

起止页码：745-750

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2017、CAS、CSCD、CSCD_E2019_2020、EMBASE、IC、JST、RCCSE、SCOPUS、WOS、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：目的:构建表达重组环氧合酶1(COX1)真核表达载体,验证其体外能够催化底物合成前列腺素E1(PGE1),以寻找高效获得PGE1的方法。方法:提取人微血管内皮细胞(HMECs)总RNA,逆转录成cDNA,以cDNA为模板,PCR扩增人COX1基因,经双酶切后与真核表达载体pCMV6连接,构建重组pCMV6-COX1真核表达质粒。通过生物信息学在线工具分析COX1蛋白的疏水性、跨膜区域、信号肽、二级结构和三级结构。采用脂质体将重组质粒转染至HEK-293F细胞中,将细胞随机分为对照组(未转染重组质粒的HEK-293F细胞)、转染重组质粒2 d组和转染重组质粒5 d组,分别收集细胞和细胞培养上清,Western blotting法检测COX1蛋白表达水平。比较真核表达的COX1蛋白与羊精囊提取法制备的粗酶混合物催化底物二高-γ-亚麻酸合成PGE1的酶活性。结果:经PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建pCMV6-COX1重组载体,目的基因长度约为1800 bp。生物信息学分析,COX1蛋白为水溶性蛋白,1~53位氨基酸为信号肽,34~53位氨基酸处于跨膜区域,有36个丝氨酸磷酸化位点、14个苏氨酸磷酸化位点和9个酪氨酸磷酸化位点。二级结构预测,不规则卷曲所占比例为46.20%,其次为α螺旋占41.03%。延伸链和β-转角分别占10.18%和2.58%。Western blotting法检测,重组质粒成功转染至HEK-293F细胞中,与转染重组质粒2 d组比较,转染重组质粒5 d组细胞培养上清中COX1蛋白表达水平明显升高(P<0.05),蛋白相对分子质量为70000。当底物浓度为1%时,COX1蛋白催化底物合成PGE1的含量为(50.01±1.37)ng·L-1,其活性相当于5个羊精囊制备的粗酶活性的(90.30±0.06)%。结论:通过基因工程技术构建和表达的COX1蛋白能够催化底物合成PGE1并满足临床要求。

关 键 词：前列腺素E1 环氧合酶1  真核表达 重组载体  催化活性

分 类 号：Q78]