文献类型：期刊文章

作　　者：张洲[1] 操孙润[1] 武晋英[1] 马孟涛[1] 宋晓宇[1]

ZHANG Zhou;CAO Sunrun;WU Jinying;MA Mengtao;SONG Xiaoyu(Institute of Translational Medicine,China Medical University,Shenyang 110122,China)

机构地区：[1]中国医科大学转化医学研究院,沈阳110122

出　　处：《中国医科大学学报》

基　　金：国家自然科学基金(31300963);辽宁省高等学校基本科研项目(LFWK201725);辽宁省重点研发计划指导计划项目(2018225083);沈阳市科技计划(17-2311-83)。

年　　份：2020

卷　　号：49

期　　号：3

起止页码：193-197

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2017、BIOSISPREVIEWS、CAB、CAS、CSA、CSA-PROQEUST、CSCD、CSCD_E2019_2020、IC、JST、RCCSE、WOS、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：目的通过常间回文重复序列丛集(CRISPR)/常间回文重复序列丛集关联蛋白9(Cas9)系统敲除技术靶向敲除人源结肠癌HCT116细胞中的SAMHD1基因,并初步研究敲除该基因后HCT116细胞增殖能力的变化。方法利用单向导RNA(sgRNA)在线设计工具,针对SAMHD1设计sgRNA;利用pYSY-CMV-Cas9-EF1α-Puromycin质粒载体,构建pYSY-CMV-Cas9-EF1α-PuromycinsgRNA-SAMHD1;转染HCT116细胞株,以嘌呤霉素进行筛选鉴定后,采用蛋白质印迹法检测HCT116细胞中SAMHD1蛋白表达水平;采用蛋白质印迹法检测靶向敲除SAMHD1基因后HCT116细胞株DNA损伤修复能力的变化;通过光学显微镜和CCK-8法比较Cas9-vector组(HCT116细胞中转染pYSY-CMV-Cas9-EF1α-Puromycin载体质粒,对照组)和Cas9-SAMHD1组(转染pYSY-CMVCas9-EF1α-Puromycin-sgRNA-SAMHD1靶向敲除SAMHD1质粒,实验组)的细胞数量和增殖能力水平。结果通过酶切载体、退火产物结果和重组质粒的测序结果,验证重组质粒构建成功;蛋白质印迹法检测结果验证明利用CRISPR/Cas9系统技术靶向敲除SAMHD1的HCT116细胞株无SAMHD1蛋白表达,即Cas9-SAMHD1细胞株构建成功;蛋白质印迹法结果显示,Cas9-SAMHD1组与Cas9-vector组相比,在DNA损伤诱导剂阿霉素刺激作用下DNA损伤指标γH2AX降低;光学显微镜和CCK-8结果显示,Cas9-SAMHD1组与Cas9-vector组相比,细胞增殖能力显著增强(P<0.01)。结论采用CRISPR/Cas9系统成功敲除人源结肠癌细胞SAMHD1基因后,结肠癌细胞的增殖能力和DNA损伤修复能力显著增强。

关 键 词：CRISPR/Cas9系统  结肠癌 HCT116 SAMHD1  细胞增殖

分 类 号：Q28]