文献类型：期刊文章

作　　者：黄丽[1] 刘珊珊[2] 张晓锋[1] 白银山[3] 刘铭[1]

HUANG Li;LIU Shan-shan;ZHANG Xiao-feng;BAI Yin-shan;LIU Ming(Oncology Research Platform,School of Basic Medical Sciences,Guangzhou Medical University,Guangzhou 511436,China;Department of Histology and Embryology,School of Basic Medical Sciences,Guangzhou Medical University,Guangzhou 511436,China;Department of Physiological and Biochemical,School of Life Science and Engineering,Foshan University,Foshan 528231,China)

机构地区：[1]广州医科大学基础医学院肿瘤学研究平台,广州511436 [2]广州医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室,广州511436 [3]佛山科学技术学院生命科学与工程学院生理生化教研室,广东佛山528231

出　　处：《中国临床解剖学杂志》

基　　金：国家自然科学基金（81702400）;广州医科大学青年科研项目（2016A03）

年　　份：2020

卷　　号：38

期　　号：1

起止页码：39-44

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2017、CSCD、CSCD_E2019_2020、JST、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：目的利用优化的pLV-Tet3G-CRISPR/Cas9载体系统构建条件性敲除CHD1L的QGY-7703肝癌细胞系,验证敲除效果及其对细胞生物学的影响,为研究CHD1L促肿瘤细胞恶性表型机制提供重要的细胞模型。方法用点突变方法优化pLV-Tet3G-Cas9载体以降低其脱靶效应,进而将Cas9改造成eSpCas9;其次,通过筛选获得稳定表达eSpCas9的QGY-7703细胞株;将mCherry基因插入载体pLVXhU6-SgRNA中,获得携带mCherry荧光基因的pLVX-mCherry-hU6-SgRNA载体;设计和筛选特异性靶向CHD1L的SgRNA序列,用重叠PCR方法获得hU6-CHD1L-SgRNA片段,筛选具有CHD1L切割活性的靶点,随后,将其克隆到pLVX-mCherry-hU6-SgRNA载体中;用293FT细胞进行病毒包装,获得慢病毒颗粒;转染7703eSpCas9细胞株,利用Western blot验证Dox诱导下的CHD1L敲除效果,划痕和Transwell实验检测Dox诱导的CHD1L敲除对肝癌细胞生物学功能的影响。结果 pLV-Tet3G-Cas9载体Cas9成功优化为eSpCas9序列;成功构建pLVX-mCherry-hU6-CHD1L-SgRNA载体;通过转染及筛选,获得Dox诱导的CHD1L敲除QGY-7703肝癌细胞系;细胞实验显示Dox可诱导eSpCas9表达,靶向性切割CHD1L,抑制QGY-7703细胞的迁移侵袭。结论成功构建Dox诱导的CHD1L敲除肝癌细胞株,此载体系统可为靶向肿瘤特异性基因研究提供细胞模型。

关 键 词：CRISPR/eSpCas9  CHD1L  SgRNA  肝癌细胞

分 类 号：R730.2]