文献类型：期刊文章

作　　者：生欣[1] 王俊华[1] 刘月华[1] 郜双林[1] 谢夏丹[1] 范芳[1]

Xin Sheng;Jun-hua Wang;Yue-hua Liu;Shuang-lin Gao;Xia-dan Xie;Fang Fan(Department of Biochemistry,School of Basic Medical Sciences,Zunyi Medical University,Zunyi,Guizhou 563000,China)

机构地区：[1]遵义医学院基础医学院生物化学教研室,贵州遵义563000

出　　处：《中国现代医学杂志》

基　　金：国家自然科学基金(No:31360278);遵义医学院博士启动基金项目(No:F566)

年　　份：2019

卷　　号：29

期　　号：1

起止页码：15-22

语　　种：中文

收录情况：CAS、IC、JST、RCCSE、ZGKJHX、普通刊

摘　　要：目的获得蓬乱蛋白2(DVL2)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并在人脐静脉内皮细胞中(h UVECs)稳定表达。方法 (1)聚合酶链反应扩增目的基因,设计合成sh RNA,以慢病毒表达质粒为基础构建DVL2干扰和过表达载体,酶切电泳、实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)和测序技术鉴定载体构建是否成功;(2)以3质粒系统在HEK293T细胞中包装病毒,通过荧光显微镜观察计数并计算病毒滴度;以嘌呤霉素筛选稳定转染的h UVECs,通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为BC组(h UVECs空白对照)、NC组(HBLV-GFP-PURO阴性对照)、干扰组(pHB-shRNA-HDVL2)及过表达组(pHBLV-HDVL2)。(3)通过q RT-PCR与Western blotting检测分别从m RNA和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果 (1)插入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。干扰序列峰形图为单峰,无突变。(2)病毒包装后,NC组、干扰组、过表达组滴度分别为2×108、2×108和1×108 TU/ml,感染人脐静脉内皮细胞的感染效率达98%。(3)干扰组DVL2的表达较BC组降低,差异有统计学意义(P <0.05),过表达组较BC组升高,差异有统计学意义(P <0.05),其中干扰效率为61%,蛋白质过表达水平为BC组的2.7倍。结论 DVL2基因干扰和过表达慢病毒载体构建成功,并能够在原代h UVECs中稳定表达。

关 键 词：蓬乱蛋白2/Wnt蛋白质类  慢病毒载体 内皮细胞  RNA干扰  过表达

分 类 号：R34[基础医学类]