文献类型：期刊文章

作　　者：曾华沙[1] 姚俊[1] 王红顺[1] 王盈[2] 杨海元[2] 曹新[1] 戴一凡[2]

机构地区：[1]南京医科大学生物技术系 [2]江苏省异种移植重点实验室,江苏南京211166

出　　处：《南京医科大学学报（自然科学版）》

基　　金：国家自然科学基金(81771000;31571302);江苏省重点研发计划(社会发展)项目(BE2016762)

年　　份：2018

卷　　号：38

期　　号：2

起止页码：149-154

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2017、CAS、CSCD、CSCD_E2017_2018、IC、JST、RCCSE、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：目的:基于CRISPR/Cas9技术构建猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)OSBPL2敲除细胞系,为构建小型猪致聋基因缺陷动物模型奠定重要的前期工作基础。方法:首先通过生物信息学方法对人与猪OSBPL2基因共线性和同源性进行分析,预测并模拟人与猪OSBPL2蛋白质二级、三级结构。其次,设计合成靶向猪OSBPL2第5、6外显子设计单导向RNA(single guide RNA,sg RNA),以p X330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组载体,转染至猪PFFs中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,T7EN1酶切实验检测靶向效率,序列分析检测单克隆细胞基因型。结果:生物信息学分析结果表明人与猪的OSBPL2在染色体上具有较好的共线性关系,蛋白质氨基酸同源性高达88%,且具有相似的功能结构域。成功构建打靶OSBPL2基因的Cas9/sg RNA表达载体,转染PFFs细胞,药物筛选获得OSBPL2基因双敲的单细胞克隆并测序证实了基因突变型。结论:人和猪OSBPL2基因具有高度的同源性。构建成功的Cas9/sg RNA表达载体在PFFs中预期实现了OSBPL2基因编辑并获得基因双敲的单细胞克隆,为后续OSBPL2基因敲除猪模型构建提供了必需的实验材料。

关 键 词：OSBPL2  共线性分析  CRISPR/Cas9  PFFs  

分 类 号：Q26]