文献类型：期刊文章

作　　者：高德俊[1] 常爽[1] 单秀梅[1] 范巍巍[1] 毛佐华[1]

GAO De-jun;CHANG Shuang;SHAN Xiu-mei;FAN Wei-wei;MAO Zuo-hua(Department of Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, Chin)

机构地区：[1]复旦大学基础医学院病原生物学系,上海200032

出　　处：《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》

年　　份：2017

卷　　号：35

期　　号：6

起止页码：570-574

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2014、CAB、CAS、CSCD、CSCD2017_2018、JST、PUBMED、RCCSE、SCOPUS、WOS、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：目的构建带有Flag标签的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白16(ROP16)的重组慢病毒表达质粒,并检测ROP16蛋白在神经细胞中的表达及其对小鼠脑神经细胞凋亡的影响。方法PCR扩增带Flag标签的ROP16基因,克隆至慢病毒载体,构建重组质粒p CDH-cop GFP-ROP16-Flag,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞,采用PCR、双酶切及测序验证。将重组质粒转染至人胚胎肾上皮细胞(293T细胞)中进行慢病毒包装,以p CDH-CMV-cop GFP空质粒对照组,荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况,并计算慢病毒滴度。将包装后的慢病毒感染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),采用蛋白质印迹(Western blotting)检测ROP16蛋白的表达情况。应用立体定位注射技术将慢病毒浓缩液注射至小鼠前额叶皮层M1区,2周后取小鼠脑组织,制备冰冻切片,TUNEL染色后,荧光显微镜下观察小鼠脑神经细胞凋亡情况。结果重组慢病毒表达质粒p CDH-cop GFP-ROP16-Flag经PCR和双酶切后均获得大小为2 200 bp的条带,与预期值相符;测序结果与刚地弓形虫RH株ROP16基因(Gen Bank登录号为GQ249093.1)序列比对完全一致。包装后的慢病毒在荧光显微镜下可见绿色荧光,滴度约为2E+8 TU/ml。Western blotting分析结果显示,在相对分子质量(Mr)120 000处有特异条带,重组慢病毒表达质粒能够在SH-SY5Y细胞内表达ROP16蛋白。感染慢病毒的小鼠脑组织冰冻切片经TUNEL染色后,荧光显微镜下可见实验组凋亡的细胞明显多于空质粒对照组。结论构建的慢病毒表达质粒p CDH-cop GFP-ROP16-Flag可在神经细胞内表达ROP16蛋白,并可导致小鼠脑神经细胞凋亡。

关 键 词：刚地弓形虫 ROP16  脑神经细胞 凋亡

分 类 号：R382.5]