文献类型：期刊文章

作　　者：郭亚璐[1] 马晓飞[2] 史佳楠[1] 张柳[1] 张剑硕[1] 黄腾[1] 武鹏程[2] 康昊翔[2] 耿广荟[2] 陈浩[2] 魏健[1] 窦世娟[1] 李莉云[1] 尹长城[2] 刘国振[1]

机构地区：[1]河北农业大学生命科学学院,河北保定071001 [2]北京华大蛋白质研发中心有限公司,北京101318

出　　处：《中国农业科学》

基　　金：高等学校博士学科点专项科研基金(20131302110006)

年　　份：2017

卷　　号：50

期　　号：19

起止页码：3631-3639

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2014、CAB、CAS、CSCD、CSCD2017_2018、GEOBASE、IC、JST、RCCSE、SCOPUS、WOS、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：【目的】制备抗CAS9蛋白质的单克隆抗体,建立转基因水稻中CAS9蛋白质的免疫印迹检测方法,了解CAS9蛋白质在转基因水稻中的表达特征。【方法】以带Cas9的质粒DNA为模板,PCR扩增Cas9 5′端810 bp片段后克隆到p ET30a载体中,将酶切验证且序列正确的重组质粒转入表达菌Condon Plus中,经IPTG诱导表达CAS9蛋白质(N端270氨基酸),用纯化的重组蛋白质作为免疫原免疫小鼠,制备单克隆抗体,用免疫印迹分析筛选特异性和灵敏度高的抗体细胞株。用特异性引物PCR扩增转基因水稻的Cas9,用免疫印迹检测转基因水稻中的CAS9蛋白质。将重组CAS9蛋白质和带有CAS9的水稻苗期叶片蛋白质进行平行免疫印迹分析,用Image J软件采集信号绘制CAS9蛋白质的标准曲线,进而对水稻叶片中的CAS9蛋白质进行定量分析。提取单粒稻米的总蛋白质,稀释后用免疫印迹分析CAS9蛋白质的检测下限,提取多个时期、部位的水稻材料的总蛋白质,包括苗期的地上部和地下部,分蘖期的茎、茎节、叶鞘、叶片等,用SDS-PAGE分离后免疫印迹检测比较CAS9蛋白质的表达特征。【结果】通过体外克隆、诱导表达获得了纯化的重组CAS9蛋白质N端片段,免疫小鼠后得到42株阳性杂交瘤细胞株,经筛选鉴定到#12D2细胞株对水稻样品的检测具有较好的特异性和灵敏度。用该抗体通过免疫印迹检测了转基因水稻,所建立的免疫印迹方法对重组CAS9蛋白质的检测下限约为0.25 ng。在水稻苗期叶片中,CAS9蛋白质约占鲜重的0.00005%,可检出单粒稻米8%样品(约2 mg)中的CAS9蛋白质。在苗期地上部CAS9蛋白质的表达丰度高于地下部,分蘖期茎和叶片中表达量较高,根和叶鞘表达量较低。【结论】获得特异性强、灵敏度高的抗CAS9单克隆抗体,建立了检测转基因水稻中CAS9蛋白质的免疫印记方法,揭示了CAS9蛋白质在水稻不同部位的表达特征,并展示了在其他植�

关 键 词：水稻 转基因植物 CAS9蛋白质  单克隆抗体 免疫印迹

分 类 号：S511]