文献类型：期刊文章

作　　者：高晶[1] 邓云[1] 陈宇[1] 高建芳[1] 傅雪珂[1] 尹丽阳[1] 万永奇[1] 吴秀山[1] 李永青[1]

GAO Jing DENG Yun CHEN Yu GAO Jianfang FU Xueke YIN Liyang WAN Yongqi WU Xiushan LI Yongqing(Center for Heart Development, Key Lab of MOE for Development Biology and Protein Chemistry, College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081, Hunan, China)

机构地区：[1]湖南师范大学生命科学学院蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室心脏发育中心,湖南长沙410081

出　　处：《激光生物学报》

基　　金：国家自然科学基金面上项目(81470377;81270156);湖南省科技支撑计划项目(2014SK3099);湖南省生物发育工程及新产品研发协同创新中心(2013-448-6)

年　　份：2016

卷　　号：25

期　　号：6

起止页码：559-563

语　　种：中文

收录情况：CAS、ZGKJHX、普通刊

摘　　要：为了在动物体内研究Fbxl5基因是通过什么机制导致斑马鱼心脏出现突变表型,本文利用近几年兴起的CRISPR/Cas9打靶技术建立斑马鱼Fbxl5基因敲除品系。本文将打靶位点定位于Fbxl5的F-box结构域,也就是Fbxl5的第五号外显子上。首先经过基因打靶网站分析筛选出针对Fbxl5基因F-box结构域最适合的打靶位点,扩增出Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶双链DNA,并转录为RNA,与Hcas9共注射至斑马鱼胚胎。最后,在注射48 h后对Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶的有效性进行检测。首先在注射48 h之后收集胚胎提取基因组DNA,用特异性引物进行PCR扩增;将纯化后的Fbxl5基因PCR产物连接到p MD18-T载体,再经质粒提取,测序分析,通过与WT斑马鱼基因组序列进行比对发现Fbxl5-9号在PAM序列AGG下游缺失了4个碱基。证明该CRISPR/Cas9系统在敲除心脏发育候选基因Fbxl5是有效的,该研究为最终获得Fbxl5基因敲除斑马鱼奠定了良好的基础。

关 键 词：Fbxl5  F-box基因家族  CRISPR/Cas9  基因敲除

分 类 号：Q78]