文献类型：期刊文章

作　　者：陈航[1] 牛秀然[1] 高嫒嫒[1] 张思河[1]

CHEN Hang NIU Xiuran GAO Aiai ZHANG Sihe(Department of Biochemistry, School of Medicine, Nankai University, Tianjin 300071, China)

机构地区：[1]南开大学医学院生物化学教研室,天津300071

出　　处：《细胞与分子免疫学杂志》

基　　金：国家自然科学基金(81373318);高等学校博士点专项科研基金(20130031120037);天津市自然科学基金(16JCYBJC23900);药物化学国家重点实验室开放基金(20130575)

年　　份：2016

卷　　号：32

期　　号：10

起止页码：1311-1316

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2014、CAS、CSCD、CSCD2015_2016、IC、JST、PUBMED、RCCSE、SCOPUS、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：目的构建葡萄糖调节蛋白75(GRP75)不同结构域、不同形式突变体与线粒体信号肽重组蛋白并鉴定其亚细胞定位。方法通过重叠延伸PCR,将线粒体靶向信号肽序列分别与GRP75不同结构域基因拼接。利用定点突变PCR分别扩增实现62和65位氨基酸突变的磷酸化失活型、磷酸化激活型突变体、482位氨基酸突变的底物结合缺陷型突变体及三位点同时突变重组体。将上述重组基因克隆入p EGFPC1真核表达质粒,酶切和测序验证后分别用脂质体转染He La细胞,Western blot法检测重组蛋白表达水平,激光共聚焦显微镜观察比较重组蛋白亚细胞定位情况。结果成功构建了线粒体信号肽融合或缺失的GRP75结构域、磷酸化失活和激活突变体、底物结合缺陷突变体真核表达质粒。各重组质粒的片段插入、位点突变、信号肽融合情况均符合设计目的,在He La细胞表达后产物的相对分子质量大小均符合预期。EGFP蛋白C端插入信号肽能引导下游融合的GRP75全长蛋白、结构域片段、突变体蛋白表达定位于He La细胞线粒体中,而缺失信号肽的对应重组蛋白则主要分布于胞质和局部核周。结论构建了一系列GRP75重组真核表达质粒,EGFP融合信号肽能引导重组蛋白在线粒体中表达定位。

关 键 词：葡萄糖调节蛋白75(GRP75)  线粒体靶向信号肽  重叠延伸PCR 亚细胞定位  

分 类 号：R394.2] R392.33[基础医学类]