文献类型：期刊文章

作　　者：阮碧波[1] 符吴萸[1] 芮雯[2] 陈海璇[3] 周朋君[2] 廖双叶[2] 吴小清[1] 王一飞[3] 陈宏远[1]

机构地区：[1]广东药科大学基础学院病原生物学与免疫学系 [2]广东药科大学中心实验室,广东广州510006 [3]暨南大学生物医药研究开发基地,广东省生物工程药物重点实验室,基因工程药物国家工程研究中心,广东广州510632

出　　处：《细胞与分子免疫学杂志》

基　　金：广东省海洋渔业局项目(GD2012-D01-002,A1201301C06);广东省科技计划项目(2015A020211036);广州市科技计划(2014J4100058)

年　　份：2016

卷　　号：32

期　　号：3

起止页码：308-312

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2014、CAS、CSCD、CSCD2015_2016、IC、JST、PUBMED、RCCSE、SCOPUS、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：目的克隆人八聚体结合蛋白4(Oct4)c DNA,研究其在原核及真核系统中的表达。方法提取人宫颈癌He La细胞中的总RNA,经反转录PCR获得c DNA,PCR扩增Oct4 c DNA并将其分别克隆入表达载体p ET-22b(+)原核质粒和pc DNATM3.1(+)真核质粒,构建含该序列的重组原核表达载体p ET-22b(+)-Oct4和真核表达载体pc DNA3.1(+)-his-Oct4。然后分别进行双酶切和测序鉴定。前者在E.coli BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,后者以脂质体介导法转染至HEK293T细胞,SDS-PAGE和Western blot法检测细菌和细胞中OCT4蛋白的表达水平。结果 PCR扩增得到约1100 bp目的 DNA片段;重组表达质粒p ET-22b(+)-Oct4和pc DNA3.1(+)-his-Oct4经双酶切鉴定和测序分析证明载体构建成功;p ET-22b(+)-Oct4经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达后SDS-PAGE分析表明,目的蛋白在宿主E.coli BL21(DE3)中高效表达OCT4融合蛋白,相对分子质量(Mr)约38 000,与其理论Mr基本相符;pc DNA3.1(+)-his-Oct4转染HEK293T细胞经Western blot法检测,证实导入的Oct4成功表达。结论在大肠杆菌和HEK293T细胞成功表达OCT4蛋白。

关 键 词：Oct4基因  分子克隆 原核表达  真核表达

分 类 号：Q785] Q786