文献类型：期刊文章

作　　者：张永江[1] 辛言言[1] 李桂芬[1] 乾义柯[2]

机构地区：[1]中国检验检疫科学研究院植物检疫研究所,北京100176 [2]伊犁出入境检验检疫局,新疆伊宁835000

出　　处：《中国农业科学》

基　　金：国家质检公益性行业科研专项(201210214);新疆维吾尔自治区科技支疆项目(2013911090)

年　　份：2016

卷　　号：49

期　　号：1

起止页码：103-109

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2014、CAB、CAS、CSCD、CSCD2015_2016、FSTA、GEOBASE、IC、JST、RCCSE、SCOPUS、WOS、ZGKJHX、ZR、核心刊

摘　　要：【目的】葡萄A病毒（Grapevine virus A,GVA）是葡萄皱木复合病的重要病原之一,以带毒种苗的嫁接为田间主要传播途径。使用无毒葡萄苗木进行生产是控制该病毒病害的根本措施,而简便灵敏的检测技术是筛选无毒种苗的有效保证。为此,开展针对GVA的反转录环介导等温扩增技术（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP）研究,旨在建立其RT-LAMP特异性检测方法。【方法】通过比对分析GVA的CP（coat protein）基因序列并经引物设计软件Primer Explore 4.0设计,获得6条检测引物GVA-FIP（5′-CTTACAGCCACGCTCAGAGTCC-CGTGGGAAGTTGGTTGTGT-3′）、GVA-BIP（5′-GCCCGTCAAAGGGGCTACAC-TCATA GGCGTTCTGTGCGA-3′）、GVA-F3（5′-AGAAGATGGGGATAGACCCG-3′）、GVA-B3（5′-CCGCCATTAACACGAGGAA-3′）、GVA-LF（5′-AT CCTTCCCACCAGCTCGG-3′）和GVA-LB（5′-TCAGGCAGATGTGTGAACCT-3′）。将RT-LAMP的反应温度分别设为59、61、63和65℃,根据1 h扩增曲线出现的先后次序确定最佳反应温度。以同样侵染葡萄的沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting-associated virus,GRSPa V）、葡萄卷叶病毒（Grapevine leafrollassociated virus,GLRa V）、葡萄斑点病毒（Grapevine fleck virus,GFKV）的阳性材料及阴性对照（健康葡萄叶片,用NC表示）的总RNA为模板,对RT-LAMP方法的特异性进行测定。将GVA的总RNA进行10倍梯度稀释,得到10^1、10^2、10^3、10^4、10^5、10^6倍的不同稀释液后用作模板分别进行RT-LAMP和普通RT-PCR检测,比较两者的灵敏度。RT-LAMP产物可进行实时扩增曲线检测,阳性样品在浊度仪上出现扩增曲线,阴性样品无扩增曲线;还可进行染料颜色反应检测,在反应产物中加入SYBR Green I染料,阳性样品产生肉眼可见的绿色,阴性反应为橙色。【结果】建立了GVA的RT-LAMP快速特异性检测方法,最佳反应温度为65℃。该方法约27 min即可检测到扩增曲线,而普通RT-PCR获得检测

关 键 词：葡萄A病毒  反转录环介导等温扩增技术  检测  

分 类 号：S432.41]