文献类型：期刊文章

作　　者：马凯[1] 胡红霞[1] 于婧[1] 周丹[1] 孙艳[1] 马磊[1] 沈波[1]

机构地区：[1]南京医科大学病原生物学系,江苏南京210029

出　　处：《中国病原生物学杂志》

年　　份：2015

卷　　号：10

期　　号：6

起止页码：495-499

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2014、CAB、CSCD、CSCD_E2015_2016、JST、RCCSE、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：目的以pMIR-reporter为载体骨架,通过双酶切方法和同源重组方法构建载体,比较两种不同载体构建方法的优缺点。方法双酶切方法使用HindⅢ和MluⅠ两种限制性内切酶分别酶切pMIR-reporter和经T-A克隆后靶基因PCR片段,形成带有相同粘性末端的线性载体片段和PCR片段,然后利用T4DNA连接酶连接,连接产物转化大肠埃希菌感受态细胞,转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳性单克隆筛选并测序。同源重组方法利用同源重组原理,通过重组酶将靶基因PCR片段和经HindⅢ酶切pMIR-reporter线性载体重组连接,连接产物转化入大肠埃希菌感受态细胞中,转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳性克隆筛选并测序。结果从载体构建耗时、总步骤数和阳性率三方面进行比较,双酶切载体构建方法需要26个独立试验,试验净耗时96h,阳性率为95%;同源重组法需要14个独立试验,试验净耗时33h,阳性率为70%。结论双酶切载体构建方法步骤繁琐。同源重组法步骤相对简单,可以高效快速地构建载体,但是假阳性率略高。

关 键 词：载体  酶切 连接  同源重组

分 类 号：R37]