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期刊文章详细信息

高表达毒力因子ROP18的转基因刚地弓形虫株的建立及鉴定    

Construction and Identification of Transgenic Strain of Toxoplasma gondii High-expressing Virulence Factor ROP18

  

文献类型:期刊文章

作  者:蒋宗儒[1] 安然[1] 杨杰[2] 万俐娟[1] 都建[1,3]

机构地区:[1]安徽医科大学基础医学院生化与分子生物学教研室 [2]安徽医科大学第一临床学院 [3]安徽病原生物学省级实验室,合肥230032

出  处:《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》

基  金:国家自然科学基金资助项目(No.81271864;30801329);教育部霍英东教育基金会高等院校青年教师基金(No.131033);安徽省杰出青年基金资助项目(No.10040606Y19;1308085JGD11);国家级大学生创新创业训练计划(No.201310366008)~~

年  份:2015

卷  号:33

期  号:1

起止页码:14-18

语  种:中文

收录情况:BDHX、BDHX2014、CAB、CAS、CSCD、CSCD2015_2016、JST、PUBMED、RCCSE、SCOPUS、WOS、ZGKJHX、ZR、核心刊

摘  要:目的构建并鉴定高表达毒力因子ROP18的转基因刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)虫株。方法 RTPCR扩增刚地弓形虫RH株速殖子的ROP18基因片段。将纯化的PCR产物克隆至p CR-BluntⅡ-Topo载体构建p ROP18质粒,PCR扩增ROP18基因序列。将纯化的PCR产物亚克隆至p TUB8-myc GFPPftail-Ty1载体,构建p TUB8-ROP18-Ty1质粒。将质粒电穿孔转染刚地弓形虫RH株,刚地弓形虫悬液转移到长有贴壁细胞的培养瓶中培养,用含25μg/ml霉酚酸和50μg/ml黄嘌呤的DMEM培养基筛选高表达ROP18的刚地弓形虫RH株。免疫荧光和蛋白质印迹(Western blotting)检测ROP18在转基因刚地弓形虫株中的表达。吉氏染色比较弓形虫RH株和高表达ROP18的转基因RH株弓形虫分别感染人包皮成纤维细胞(HFF细胞)的增殖情况。20只昆明小鼠均分为2组,每鼠分别腹腔内注射1×103高表达ROP18弓形虫RH株和1×103弓形虫RH株,统计小鼠存活率。结果 RT-PCR扩增出1 665 bp的ROP18基因序列。经酶切和测序鉴定证明p TUB8-ROP18-Ty1质粒构建成功。Western blotting分析结果显示,高表达ROP18 RH株可表达相对分子质量(Mr)为56 000的蛋白,与ROP18-Ty1蛋白预期结果一致。免疫荧光结果发现,ROP18-Ty1定位于弓形虫前端的棒状体。吉氏染色结果表明,高表达ROP18 RH株弓形虫感染HFF细胞6、12和24 h后的速殖子数量分别为100.0±16.9、476.0±31.1和860.0±52.3,均显著高于RH株弓形虫(88.0±16.9,300.0±11.3,675.0±35.4)(P<0.05)。弓形虫毒力实验结果显示,RH株弓形虫感染小鼠在第8天均存活,第14天存活率下降至30%(3/10),至第16天全部死亡;高表达ROP18 RH株弓形虫感染小鼠在第5天均存活,第8天存活率下降至30%(3/10),至第9天全部死亡。结论构建了高表达毒力因子ROP18的转基因弓形虫虫株。

关 键 词:弓形虫 ROP18基因  转基因虫株  

分 类 号:R382.5]

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