文献类型：期刊文章

作　　者：谢小丽[1] 程剑松[1] 王晓敏[1] 梅香寒[1] 刘琳[1] 李静[1,2]

机构地区：[1]南开大学药学院天津市分子药物研究重点实验室,天津300071 [2]天津化学化工协同创新中心,天津300071

出　　处：《中国生物工程杂志》

基　　金：国家自然科学基金资助项目(91013013;31000371)

年　　份：2014

卷　　号：34

期　　号：1

起止页码：36-41

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2011、CAB、CAS、CSCD、CSCD2013_2014、IC、JST、RCCSE、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：传统的蛋白质生物素标记多采用体外化学修饰法,涉及生物素和蛋白质的活化、透析和纯化等多种处理,该方法步骤繁琐,且对目的蛋白的损失较大。本实验利用原核共表达质粒pCDFDuet-1,将含有6个组氨酸标签的人己糖苷酶D(hexosaminidase D,HexD)的cDNA与生物素受体多肽(biotin acceptor peptide,BAP)DNA进行PCR拼接,连入pCDFDuet-1的多克隆位点1(multiple cloning site1,MCS1);将以大肠杆菌Trans5α基因组为模板克隆得到的生物素连接酶(biotin ligase,BirA)基因连入MCS2,构建重组质粒pCDFDuet-hexD-BAP-birA。初步验证后将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,利用0.1 mmol/L的IPTG和80μmol/L的生物素进行诱导表达,采用Ni-NTA亲和层析和超滤对HexD进行纯化,SDS-PAGE检测分子量的大小(60 kDa)和纯度(90%以上)。以anti-HexD和链霉亲和素-HRP为抗体,Western blot检测发现,HexD-BAP表达正确,且被生物素标记;同时以4-MU-O-GalNAc为荧光底物,检测到生物素化标记HexD的糖苷酶活性为3.6 nmol/(min·μg),与未标记HexD的活性(3.06 nmol/(min·μg))相当。结果表明,可以利用BirA及其受体多肽,通过共表达质粒pCDFDuet-1,一步转化、表达和纯化,在大肠杆菌中进行外源蛋白的表达和生物素标记,且不改变目的蛋白的生物活性,可应用于免疫标记、互作蛋白的捕获等生物学研究。

关 键 词：原核表达 生物素标记 己糖苷酶D  

分 类 号：Q563]