文献类型：期刊文章

作　　者：徐红娜[1] 于洪巍[1]

机构地区：[1]浙江大学化学工程与生物工程学系生物工程研究所,杭州310027

出　　处：《浙江大学学报（农业与生命科学版）》

基　　金：国家自然科学基金资助项目(21176215;21176102)

年　　份：2013

卷　　号：39

期　　号：6

起止页码：607-612

语　　种：中文

收录情况：AJ、BDHX、BDHX2011、CAB、CAS、CSA-PROQEUST、CSCD、CSCD2013_2014、FSTA、IC、JST、PROQUEST、PUBMED、RCCSE、SCOPUS、UPD、WOS、ZGKJHX、ZR、核心刊

摘　　要：通过分子克隆手段获得大肠杆菌来源的羧酸酯酶BioH，采用定向进化的方法提高该酶的水解活性以提升其应用价值．通过PCR扩增，从大肠杆菌K12菌株中克隆得到羧酸酯酶BioH基因，目的基因长度为771bp，含256个氨基酸；将其连接到pET30a（＋）质粒上并转入BL21（DE3）宿主细胞中，经诱导表达得到所需的目的蛋白，该蛋白分子质量约为28．2ku．野生型的BioH水解对硝基苯丁酸酯（P—NPB）的活性为18U／mg，且该酶具有良好的热稳定性．以PNPB为底物进行高通量筛选，其水解底物为对硝基苯酚（PNP），在405nm处有最大吸收峰．挑选出水解活性提高的突变体，并通过2轮定向进化过程，成功筛选到7个水解活性提高的优良突变体，它们的活性分别提高了20％～100％．结构分析表明，突变体的突变位点均分布在远离活性中心的位置．

关 键 词：羧酸酯酶BioH  克隆 表达  定向进化 水解活性

分 类 号：Q819[生物工程类]