文献类型：期刊文章

作　　者：冯均尚[1] 窦文芳[1] 张晓梅[1] 许泓瑜[1] 史劲松[2] 许正宏[1]

机构地区：[1]江南大学药学院制药工程研究室,无锡214122 [2]江南大学药学院生物活性制品加工工程研究室,无锡214122

出　　处：《生物技术通报》

基　　金：江苏省科技支撑计划(BE2009629)

年　　份：2013

卷　　号：29

期　　号：9

起止页码：124-129

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2011、CAS、CSCD、CSCD_E2013_2014、JST、RCCSE、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：GGH是人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白(GLP-1A2G)2-HSA的简称,为研究N端添加丙氨酸的修饰对其活性的影响,通过基因工程方法成功构建表达该类似物的工程菌,并纯化得到终产物,完成了初步体外活性检测。首先运用PCR技术扩增出融合蛋白GGH类似物的基因片段,以pPIC9K为表达质粒构建了重组表达质粒,将双酶切和测序验证正确的重组质粒电转至分泌型菌株毕赤酵母GS115,然后经过MD平板筛选获得转化子,利用甲醇诱导表达72 h,SDS-PAGE检测上清产物与未修饰的GGH对比,得到阳性转化子。融合蛋白经过发酵液8 000 r/min离心10 min,0.45μm的微孔滤膜微滤,采用截留分子量为10 kD的超滤膜超滤20倍,再依次经过Blue Sepharose 6 Fast Flow、Phenyl Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、Sephadex G-25层析柱。在RINm5f细胞上测cAMP的生成,通过与阳性对照的标准曲线对比发现,A-GGH活性比GGH提高10倍,表现出较好的体外活性。

关 键 词：融合蛋白GGH  类似物 毕赤酵母 表达  纯化 活性

分 类 号：Q78]