文献类型：期刊文章

作　　者：唐冬生[1] 蒋泓[1] 刘芳[1] 王克振[2] 张勇[1] 曾芳[1] 梁沂梅[1] 邓廷贤[1] 欧阳宏佳[3] 李月琴[2] 张细权[3] 周天鸿[2]

机构地区：[1]佛山大学医学院,佛山528000 [2]暨南大学生命科学学院,广州510632 [3]华南农业大学动物科学学院,广州510642

出　　处：《科学通报》

基　　金：国家科技重大专项(2009ZX08010-023B);粤港关键领域重点项目(2008A024200006);国家自然科学基金(30871395);广东省科技攻关计划(2006B20101012)资助

年　　份：2012

卷　　号：57

期　　号：9

起止页码：711-719

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2011、CAS、CSA-PROQEUST、CSCD、CSCD2011_2012、JST、MR、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：该研究旨在建立锌指核酸酶介导的多位点基因打靶技术,为获得稳定遗传的转基因动物或基因治疗临床应用解决技术难题.首先利用OPEN平台设计、构建能识别人基因组内rDNA基因间隔序列的锌指蛋白基因序列,与FokⅠ的切割结构域连接、表达后获得锌指核酸酶基因,再构建锌指核酸酶真核表达载体.另外,构建含有2条同源重组引导序列和绿色荧光蛋白基因(EGFP)的多位点基因打靶载体.将锌指核酸酶真核表达载体和多位点基因打靶载体共转染HEK293细胞,内参对照PCR-灰度分析法检测外源基因定点整合效率,结果显示单独转染多位点基因打靶载体的定点整合效率为6.8%;而由于锌指核酸酶在染色质DNA上切割rDNA基因的间隔序列,诱导高效同源重组,锌指核酸酶载体、多位点基因打靶载体共转染的定点整合效率为24.2%,较常规基因打靶定点整合率(10-6～10-5)提高了24000多倍.共转染的HEK293细胞在无任何筛选的条件下持续培养2个月,经过20次传代之后,子代细胞能够持续表达EGFP,提示表达稳定.本研究建立了锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶技术,不仅大大提高了外源基因的定点整合效率,而且兼顾了基因表达的稳定性和安全性,为动物定点转基因和人类基因治疗提供了重要的技术平台,具有广泛的应用前景.

关 键 词：锌指核酸酶 基因打靶 多位点  同源重组 定点整合  稳定表达  转基因动物 基因治疗

分 类 号：Q78]