文献类型：期刊文章

作　　者：胡凤娟[1] 王旭曼[1] 刘大岭[1,2] 姚冬生[1,3]

机构地区：[1]暨南大学微生物技术研究所,广州510632 [2]广东省生物工程药物重点实验室,广州510632 [3]基因药物国家工程研究中心,广州510632

出　　处：《中国生物工程杂志》

基　　金：广东省科技攻关资助项目(2005B20601004)

年　　份：2011

卷　　号：31

期　　号：10

起止页码：75-82

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2008、CAB、CAS、CSCD、CSCD2011_2012、IC、JST、RCCSE、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：利用定点突变的方法提高Armillariella tabescensβ-甘露聚糖酶MAN47的胰蛋白酶抗性。首先根据其氨基酸序列,找到胰蛋白酶的水解位点—赖氨酸(Lys,K)和精氨酸(Arg,R),再利用生物信息学软件获得酶分子结构中K和R与周围溶剂的接触程度,选定暴露程度最大的K280为候选突变位点,进行模拟突变,并分析突变前后的氢键键长和整体结构的变化。根据氢键键长的变化,确定突变体为K280N。对K280N设计突变引物,用重叠延伸PCR技术对MAN47野生型man基因进行突变,PCR产物与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体PYCα连接,在大肠杆菌DH5α中扩增后转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,经人工肠液(pH 6.8 10mg/ml胰蛋白酶溶液)筛选,得到抗胰蛋白酶的最佳突变株。结果表明突变酶在用人工肠液处理180min后,其半衰期为173min,而野生型酶为99min,其他酶学性质与野生型酶基本一致。

关 键 词：定点突变 Β-甘露聚糖酶 重叠延伸PCR 同源建模 分子计算

分 类 号：Q819[生物工程类]