文献类型：期刊文章

作　　者：谭艳[1] 王家宁[2] 郭凌郧[2] 孔霞[2] 唐俊明[2] 张少峰[1] 黄永章[2] 罗超[3]

机构地区：[1]郧阳医学院附属人民医院泌尿外科研究所,湖北十堰442000 [2]郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所,湖北十堰442000 [3]郧阳医学院基础医学研究所,湖北十堰442000

出　　处：《郧阳医学院学报》

基　　金：国家自然科学基金(No:30600614);教育部重点项目(No:207072);湖北省自然科学基金(No:2006ABA342);教育厅中青年项目(No:Q200624003)

年　　份：2007

卷　　号：26

期　　号：2

起止页码：65-70

语　　种：中文

收录情况：普通刊

摘　　要：目的:利用细菌内同源重组法快速构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和人内皮型一氧化氮合酶(he-NOS)cDNA的重组腺病毒质粒和制备表达EGFP和heNOS的重组腺病毒。方法:质粒载体pHCMV SP1A-heNOS用EcoRⅠ酶切,回收heNOS cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒pShuttle-heNOS-EGFP;然后用PmeI线性化后的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定后经PacⅠ酶切,转入AD 293细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP,纯化,鉴定,滴度测定。结果:heNOS cDNA成功地插入到穿梭质粒中,pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ5183中成功发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组腺病毒经PCR检测表明携带有目的基因heNOS,滴度约为6.5×1015pfu/L。结论:细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点,制备出的高滴度重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP为勃起功能障碍的基因治疗奠定了基础,携带的EGFP标记基因可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况。

关 键 词：同源重组 人内皮型一氧化氮合酶  基因治疗  腺病毒 绿色荧光蛋白

分 类 号：Q78]