文献类型：会议

作　　者：蒋承建 胡婷婷 武波

作者单位：广西大学微生物及植物遗传工程教育部重点实验室 广西亚热带资源保护利用重点实验室

会议文献：2005热带亚热带微生物资源的遗传多样性与基因发掘利用研讨会论文集

会议名称：2005热带亚热带微生物资源的遗传多样性与基因发掘利用研讨会

会议日期：20051100

会议地点：中国海南三亚

主办单位：海南省科学技术协会;海南省生物工程协会;海南省热带农业资源开发利用研究所

出版日期：20051100

学会名称：海南省生物工程协会

语　　种：中文

摘　　要：本研究工作从碱性土壤样品中直接抽提和分离宏基因组DNA,首先构建了包含5562个阳性克隆的碱性土壤16S rDNA 文库,随机抽取9个克隆测序后构建的系统进化树表明了碱性土壤环境微生物种群基因的多样性。纯化土壤宏基因组DNA 后采用EcoRI 酶部分酶切处理,我们又构建了以pGEM-3Zf(+)为载体的DNA 部分文库AL01。AL01文库包含23650个克隆,随机插入载体的外源DNA 片段平均大小为3.2Kb 左右,DNA 文库的总容量为75.68Mb。建库效率为从每克环境样品中获得6000个左右的含随机外源DNA 片段插入载体的克隆。采用酶活筛选策略,我们从AL01文库中筛选到一个编号为pGXAA2011的阳性克隆携带有一个完整的碱性蛋白酶基因。蛋白酶活性检测其酶活作用最佳温度为40℃,最适作用pH 值为9.5。另外,我们还克隆和表达了一个新型β-葡萄糖苷酶基因unglu01,该基因和现有数据库中的β-葡萄糖苷酶基因没有任何DNA 或者氨基酸水平的同源性。将携带unglu01基因的ORF 与表达载体pET-Blue2连接后导入宿主菌株Tuner(DE3)pLacI 中,该重组表达克隆在含柠檬酸高铁铵和七叶苷的LA平板上表现清晰的β-葡萄糖苷酶活性,SDS-PAGE 电泳可以检测到29 KDa 大小的目的蛋白。

关 键 词：宏基因组 文库 未培养微生物 碱性蛋白酶 Β-葡萄糖苷酶

分 类 号：S154.3]