文献类型：会议

作　　者：王勤熙 李凯 周宇荀 邵香君 阮美玲 肖君华

作者单位：东华大学化学化工与生物工程学院生物科学与技术研究所

基　　金：国家自然科学基会(面上项目)(编号：30700529)

会议文献：中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编（2004-2008）

会议名称：中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会

会议日期：20081000

会议地点：中国重庆

主办单位：中国遗传学会

出版日期：20081000

学会名称：中国遗传学会

语　　种：中文

摘　　要：基于荧光通用引物的多重定量 RT-PCR 技术是一种对于定量的、高通量的、经济的基因表达分析简单最佳的多重解决方案,具有定量通量高(10～20个基因/反应)、成本低、样本需要量低(5ng total RNA/反应)、灵敏性高(102拷贝模板检山度,105拷贝模板混合浓度范围)等优点。这种荧光通用引物多重定量 RT-PCR 技术结合了终点 PCR 法(end-point PCR) 和荧光检测法(fluorescent detection)。反应采用了嵌合特异引物引导荧光通用引物扩增的方案,前几个循环嵌合特异引物使目的基因待扩序列的两端加上了通用引物序列,在接下来的循环过程高浓度的通用引物取代了嵌合特异引物完成整个 PCR 反应。从多对嵌合特异引物的 PCR 反应转变为一对通用引物的 PCR 反应大大降低了 PCR 反应的复杂性,并且所有待扩目的基因片段也在一对通用引物的作用下被等比例的扩增,从而实现多重定量检测。该技术平台的研发包括以下三方面的内容:引物序列设计、逆转录反应体系和多重 PCR 反应系统。引物序列设计上完成了通用引物和包括看家基因在内的10组目的基因嵌合特异引物的序列设计:逆转录反应体系的研发过程中,主要考察了下游嵌合特异引物的量,逆转录延伸时间: 多重 PCR 体系的研发过程中,主要考察了通用引物与上游嵌合特异引物的用量比,PCR 反应程序优化(Mg2+浓度、退火时间、延伸时间等),引物补加方案和最低模板检测灵敏度等。基于通用引物的多重定量 RT-PCR 技术实现定量检测的关键是能否使各个待检目的基因等效率扩增。在最优的逆转录和 PCR 反应条件下,上游嵌合特异引物会干扰通用引物的等效率扩增, 上游嵌合特异引物的量应随待检目的基因模板量的增加而减少。同时通过在待检目的基因 PCR 产物长度跨度内(100～300nt),等间距设计3个看家基因 PCR 产物抵消掉了长度对扩增�

关 键 词：通用引物 多重定量 RT-PCR  基因表达谱分析

分 类 号：Q78]