文献类型：专利

专利类型：发明专利

是否失效：否

是否授权：否

申 请 号：CN200610040035.3

申 请 日：20060429

发 明 人：李百胜 廖太林 吴翠萍 纪睿

申 请 人：中华人民共和国昆山出入境检验检疫局

申请人地址：215300 江苏省昆山市长江中路428号

公 开 日：20080604

公 开 号：CN100392103C

代 理 人：王荷英

代理机构：32206 南京众联专利代理有限公司

语　　种：中文

摘　　要：本发明涉及一种松树脂溃疡病菌的分子检测方法，利用引物设计软件Prime 5.1，设计一对镰刀菌IGS片段上的通用引物G1/G2和特异性引物S1/S2，以松树病菌样品DNA提取液为模板，进行第一轮的通用引物PCR扩增反应；随后PCR扩增产物稀释100倍，取1μl作为模板，进行第二轮的特异引物PCR扩增反应。扩增产物进行电泳检测，如果存在873bp的DNA特异性条带，则确定所检测的病菌为松树脂溃疡病菌。用本方法检测松树脂溃疡病菌，只需一个工作日的时间，检测灵敏度达到最低限量病菌DNA浓度为5×10<Sup>-3</Sup>pg/μl，分生孢子10个/100μl。本法可直接从土壤、木材以及种子中快速、灵敏、准确检测松树脂溃疡病菌，特别适合于口岸检疫等时效性要求特别强的场合使用。

主 权 项：1.松树脂溃疡病菌的分子检测方法，其特征是检测方法如下：①.提取松树病菌样品的DNA，-20℃下保存备用；②.根据GenBank公布Fusarium属IGS序列，利用引物设计软件Prime 5.1，设计一对镰刀菌核糖体基因内间隔区IGS片段上的通用引物G1/G2，其序列为：G1：5’-GCGGTGTCGGTGTGCTTGTA-3’G2：5’-ACTCACGGCCACCAAACCA-3’③.根据松树脂溃疡病菌及其近缘种、相关种IGS差异，设计一对能鉴别松树脂溃疡病菌的特异性引物S1/S2，其序列为：S1：5’-CTTACCTTGGCTCGAGAAGG-3’S2：5’-CCTACCCTACACCTCTCACT-3’④.利用特异性引物S1/S2和通用引物G1/G2，进行松树脂溃疡病菌巢式PCR扩增步骤如下：第一轮，通用引物PCR扩增：反应体系总体积为25μl，反应组分为：10×反应缓冲液2.5μl，2.5mmol/L MgCl₂1.5μl，10pmol/L上、下游通用引物G1、G2各0.5μl，10mmol/L dNTP 2μl，5u/μl Taq酶0.25μl，DMSO 1.25μl，模板松树病菌样品DNA提取液1μl，灭菌水补足25μl；扩增反应程序为：95℃变性5min，进入循环，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，20个循环后72℃延伸10min；第二轮，特异引物PCR扩增：反应体系总体积为25μl，将第1轮PCR扩增产物稀释100倍，取1μl作为模板；其它反应组分为：10×反应缓冲液2.5μl，2.5mmol/L MgCl₂ 1.5μl，10pmol/L上游引物S1、下游引物S2各0.5μl，10mmol/LdNTP2μl，5u/μl Taq酶0.25μl，DMSO1.25μl，灭菌水补足25μl；反应程序为：94℃变性3min，进入循环，94℃变性35s，66℃退火55s，72℃延伸50s，40个循环后72℃延伸12min；⑤.扩增产物进行电泳检测：取10μl扩增产物，采用1.2％的琼脂糖凝胶，在电压80V下电泳20～40分钟后在紫外灯下检测，如果存在873bp的DNA特异性条带，则确定所检测的病菌为松树脂溃疡病菌。

关 键 词：溃疡病菌 松树脂  病菌 扩增产物  扩增  检测  分子检测方法  特异引物PCR  通用引物PCR  特异性条带  特异性引物  电泳检测  设计软件 通用引物 准确检测  最低限量  灵敏度  镰刀菌 时效性  孢子  稀释  引物  松树 工作日  灵敏  木材  检疫  口岸  土壤  

IPC专利分类号：C12Q1/68(20060101)