文献类型：专利

专利类型：发明专利

是否失效：否

是否授权：否

申 请 号：CN201510293468.9

申 请 日：20150601

发 明 人：单长林 李孝军 李雪松 叶露飞 周圆 杨赛军

申 请 人：舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心

申请人地址：316000 浙江省舟山市定海昌国路222号

公 开 日：20151007

公 开 号：CN104962610A

代 理 人：尉伟敏

代理机构：33109 杭州杭诚专利事务所有限公司

语　　种：中文

摘　　要：本发明涉及一种玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法，利用GenBank公布的玉米内州萎蔫病菌16S-23S序列设计LAMP引物，建立了玉米内州萎蔫病菌LAMP检测体系，并对反应条件进行了优化。以玉米内州萎蔫病菌基因组和菌悬液梯度稀释液为模版检测LAMP体系的灵敏度，结果显示，LAMP检测体系针对基因组和菌悬液的灵敏度分别达到了50fg和3.8CFU/mL，比普通PCR灵敏度高100倍。结果表明，LAMP检测体系简单、快速、灵敏度高、特异性好，在玉米内州萎蔫病菌检测方面潜力巨大。

主 权 项：1.一种玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：a)设计引物，引物序列为：F3正向外引物：5’-CGCTCATGGGTGGAACAT-3’  (SEQ ID NO.1)；B3反向外引物：5’-GTTCTCAATATACGGGCGGT-3’  (SEQ ID NO.2)；FIP正向内引物：5’-CATGCCCTCGACACACCAGACTGATGTGTCGGGCTGCTA-3’(SEQ ID NO.3)；BIP反向内引物：5’-CGCTGTTGGGTCCTGAGGGAACGAAAGGACGACGGAAAG-3’(SEQ ID NO.4)；LF正向环化引物：5’-ACCCCACAAGGAGGCGTA-3’  (SEQ ID NO.5)；LB反向环化引物：5’-GCACCTTCGGGTGTGTCTG-3’  (SEQ ID NO.6)；b)菌体培养和DNA模版制备：菌体的活化培养用LB固体培养基，涂板后放入25℃恒温培养箱中培养24h，后挑取单菌落入LB培养液25℃培养12h(OD600＝0.8)，离心收集菌体，利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组，紫外分光光度计Nanodrop 2000检测提取质量和浓度，-20℃备用；c)LAMP扩增：步骤b)得到的基因组进行LAMP扩增，LAMP体系设置反应温度梯度为61℃、62℃、63℃、64℃或65℃；设置内引物、环化引物和外引物比例分别为2：2：1(10pmol：10pmol：5pmol)，4：4：1(20pmol：20pmol：5pmol)，6：4：1(30pmol：20pmol：5pmol)或8：4：1(40pmol：20pmol：5pmol)；设置反应时间梯度为15min、30min、45min或60min；d)分析：步骤c)得到的扩展产物以阴性对照进行目测或于2.0％琼脂糖凝胶电泳分析。

关 键 词：萎蔫 病菌 玉米  灵敏度高  基因组  菌悬液  灵敏度 病菌检测 反应条件  梯度稀释  序列设计  模版 一种  检测  普通  优化  涉及  表明  建立  进行  

IPC专利分类号：C12Q1/68(20060101);C12Q1/04(20060101)