文献类型：专利

专利类型：发明专利

是否失效：否

是否授权：否

申 请 号：CN201510218677.7

申 请 日：20150430

发 明 人：陈晨 明宏艳 王小晋 周艳容 王冰 李燕

申 请 人：广东国际旅行卫生保健中心(广东出入境检验检疫局口岸门诊部) 中华人民共和国淮安出入境检验检疫局 王小晋

申请人地址：510070 广东省广州市越秀区淘金东路75号901

公 开 日：20170301

公 开 号：CN105137072B

代 理 人：谷庆红

代理机构：11002 北京路浩知识产权代理有限公司

语　　种：中文

摘　　要：本发明涉及一种基于纳米免疫磁珠‑近红外荧光标记法的结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(LMA)检测试剂盒。本试剂盒中，以近红外荧光染料标记靶向于LAM的单克隆抗体，靶向于LAM的多克隆抗体包被在纳米磁珠表面。采用双抗体夹心法原理，磁性分离结合物和游离物，采用便携式高灵敏度低噪声激发式荧光检测仪检测磁性结合物的荧光强度，从而检测待检样品中LAM含量。本发明适用于临床病理标本中的LAM检测，具有快速、灵敏、抗杂散荧光干扰、发射荧光保存时间长的特点。

主 权 项：1.一种基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌LAM检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由近红外荧光染料标记的单克隆抗体、多克隆抗体包被的纳米磁珠、磁性分离器、蛋白标准品、缓冲液组成；其中，近红外荧光染料标记的单克隆抗体为兔抗LAM；包被纳米磁珠的多克隆抗体为兔多抗LAM；建立LAM标准品梯度浓度和荧光发射值之间的工作曲线，将所测得的发射荧光强度，代入方程即可完成样品中目标多糖含量的定量检测；所述基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌LAM检测试剂盒的制备方法，步骤如下：(1)制备近红外荧光染料标记的LAM单克隆抗体；将购自Thermofisher公司的Dylight800用pH值为7.4的PBS缓冲液稀释10倍，取1.4μL与购自Mossman Associates Inc公司的浓度为1mg/ml、20μg兔抗LAM单克隆抗体轻柔混合均匀后于室温避光反应2小时；反应结束后，将标记产物放入透析袋中，4℃，PBS缓冲液透析4小时；标记好的抗体溶液中添加终浓度为1.5％BSA和0.1％Tween20，叠氮化钠0.1‰，4℃保存；使用前将标记产物以PBS稀释2000倍；(2)LAM多克隆抗体的制备1)LAM的提纯：将MTB H37RV接种在罗氏鸡蛋培养基上，37℃培养3～4周，收取菌落置于5mlEP管中，100℃水浴灭活2小时，用2ml的pH值为7.4的PBS缓冲液洗涤2次，8000r/min、10min离心弃上清；加入2ml氯仿∶甲醇＝2∶1混合液脱脂3次，8000r/min，10min离心弃上清；加入2ml的pH值为7.4的PBS悬浮，冰浴超声破碎：超声10s，停10s，共30min，8000r/min，10min，离心取上清，加入2ml40％的苯酚萃取，70℃，1小时，8000r/min，10min离心取上清，用蒸馏水透析2天，采用SepHacryl S-100凝胶柱层析，用0.05mmol/L的NaCl溶液洗脱，流速0.5ml/min，用EP管收集2ml/管；2)LAM的定量：取浓硫酸1ml，9％苯酚200μl，标本200μl，混匀后避光反应30分钟，空白�

关 键 词：靶向  检测  近红外荧光标记  红外荧光染料  结核分枝杆菌 纳米磁珠表面  纳米免疫磁珠  双抗体夹心法 单克隆抗体  多克隆抗体  荧光检测仪  磁性分离  磁性结合  待检样品  发射荧光  甘露聚糖 高灵敏度  检测试剂  临床病理  荧光干扰  低噪声  激发式  结合物  试剂盒  游离物  荧光 包被  杂散 灵敏  保存  标本  

IPC专利分类号：G01N33/569(20060101);G01N33/543(20060101);G01N33/58(20060101)