文献类型：专利

专利类型：发明专利

是否失效：否

是否授权：否

申 请 号：CN201510638083.1

申 请 日：20150930

发 明 人：汤华东 吴红梅 朱德芳 陈亚 陈煌

申 请 人：武汉海特生物制药股份有限公司

申请人地址：430223 湖北省武汉市经济技术开发区海特科技园(珠山湖大道66号)

公 开 日：20160120

公 开 号：CN105250226A

代 理 人：张瑾

代理机构：11228 北京汇泽知识产权代理有限公司

语　　种：中文

摘　　要：本发明公开了一种猪凝血酶冻干粉的制备方法，包括以下步骤：抗凝猪血浆与凝胶混合搅拌吸附，过柱洗脱获得凝血酶原溶液；向兔脑粉中加入生理盐水，再加入凝血酶原溶液和CaCl<Sub>2</Sub>进行酶原激活，得凝血酶粗酶液，超滤脱盐并浓缩，进行病毒灭活，所得粗酶液过DEAE-Sepharose？Fast？Flow层析柱，洗脱收集目的峰，即得猪凝血酶；猪凝血酶加入甘露醇或右旋糖酐40，过滤除菌，分装，冻干，真空压塞，轧铝塑组合盖后，得猪凝血酶冻干品；冻干品在100℃下进行干热处理以再次灭活病毒，包装即得猪凝血酶冻干粉。产品中猪凝血酶比活性不低于130U/mg，整个工艺步骤简单、易实施，提高了制品安全性，适合于工业化生产。

主 权 项：1.一种猪凝血酶冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)抗凝猪血浆与经过含有Na₂B₄O₇3.75mmol/L和H₃BO₃85mmol/L且pH值为8.0的硼酸-硼砂缓冲液平衡的QAE-SephadexA50凝胶按照1L:1～1.5g的用量混合，室温搅拌吸附，用双层400目绸布过滤收集吸附有凝血酶原的凝胶，装填层析柱，先用纯化水流洗至基线走平，再用0.1mol/L的NaCl流洗至基线走平，最后用含0.4mol/L的NaCl和2mmol/L的BaCl₂的洗脱液洗脱，收集目的峰，获得凝血酶原溶液；(2)按兔脑粉与生理盐水为1g∶20mL的比例，向兔脑粉中加入45℃的生理盐水，保持45～50℃搅拌提取15～20分钟后，2000rpm离心5分钟，收集上清液；按照上清液:凝血酶原溶液:CaCl₂＝4.7mL:1L:1.4g的用量进行配比混合搅拌均匀后，于25～31℃水浴中静置激活1～2hr进行酶原激活，然后于4℃5000rpm离心10min，用双层400目绸布过滤，收集上清得凝血酶粗酶液；(3)凝血酶粗酶液用截留分子量8000道尔顿的超滤膜超滤脱盐并浓缩10～20倍，进液压控制在0.15MPa以内，回流压控制在0.1MPa以内，浓缩后的粗酶液中加入病毒灭活剂搅拌均匀后，于24～26℃下保温6～8hr，进行病毒灭活；所述病毒灭活剂包括终浓度3g/L的磷酸三丁酯和终浓度10g/L的吐温-80；或者所述病毒灭活剂包括终浓度3g/L的磷酸三丁酯和终浓度10g/L的TritonX-100。(4)灭活病毒后的粗酶液过DEAE-SepharoseFastFlow层析柱，先用平衡液流洗至基线走平后，用洗脱液洗脱收集目的峰，即得猪凝血酶；(5)步骤(4)所得猪凝血酶加入终浓度为15～35g/L的甘露醇或右旋糖酐40，过滤除菌，分装，冻干，真空压塞，轧铝塑组合盖后，得猪凝血酶冻干品；(6)猪凝血酶冻干品在100℃下进行干热处理30～120min以再次灭活病毒，然后进行包装，即得猪凝血酶冻干粉。

关 键 词：猪凝血酶  凝血酶  凝血酶原  粗酶液  冻干粉  冻干品 洗脱  铝塑组合盖  右旋糖酐40 制品安全性  病毒灭活  超滤脱盐  干热处理 工艺步骤  过滤除菌  酶原激活  灭活病毒  生理盐水  真空压塞  制备方法  加入  比活性  层析柱  甘露醇  猪血浆 冻干  分装  过柱  抗凝  凝胶  兔脑 吸附  中猪  种猪 浓缩  进行  低于  收集  公开  

IPC专利分类号：A61K9/19(20060101);A61K38/48(20060101);A61P7/04(20060101);C12N9/74(20060101)