文献类型：专利

专利类型：发明专利

是否失效：否

是否授权：否

申 请 号：CN202110681384.8

申 请 日：20210618

发 明 人：李桂花 卢俊裕 王森

申 请 人：广州铭康生物工程有限公司

申请人地址：510000 广东省广州市经济技术开发区金峰园路1号

公 开 日：20220107

公 开 号：CN113337490B

代 理 人：张帅

代理机构：44416 广州科沃园专利代理有限公司

语　　种：中文

摘　　要：本发明属于蛋白分离纯化技术领域，具体涉及一种大规模快速分离纯化rhTNK‑tPA I/II型的方法。本发明提供了一种适合分离rhTNK‑tPA I/II型的层析方法，使得分离同等量的rhTNK‑tPA I/II型的层析时间较公开技术减少50％以上，实现了短时间内高效处理和大规模制备rhTNK‑tPA I/II型的目标。分离后的rhTNK‑tPA I型冻干成品经SDS‑PAGE检测I型比例&gt;95％，比活为3.3×10<Sup>5</Sup>IU/mg；rhTNK‑tPA II型冻干成品经SDS‑PAGE检测II型比例为100％，比活为6.5×10<Sup>5</Sup>IU/mg。

主 权 项：1.一种大规模快速分离纯化rhTNK-tPA I/II型的方法，其特征在于，包含以下步骤：S1、将rhTNK-tPA原液经注射用水稀释4~8倍，获得稀释后的rhTNK-tPA原液；S2、用平衡缓冲液A平衡Lysine HyperD层析柱后，将步骤S1所得稀释后的rhTNK-tPA原液上样，上样后再用平衡缓冲液A进行后平衡，平衡后用洗脱液a进行2CV线性洗脱，洗脱过程出现两个峰时，分段收集I型目标峰和II型目标峰；S3、采用SDS-PAGE法检测S2目标峰收集液中rhTNK-tPA I型或II型的比例，选择比例＞95%的收集液再分别进行下一步层析；S4、用平衡缓冲液B平衡Sephadex G-25层析柱后，将步骤S3得到的rhTNK-tPA I型或rhTNK-tPA II型收集液直接上样，上样体积为20~30% CV，以洗脱液b进行洗脱，收集目标峰，即得到rhTNK-tPA I型原液或rhTNK-tPA II型原液；S5、将步骤S4收集到的rhTNK-tPA I型原液或rhTNK-tPA II型原液进行稀配，用洗脱液b稀释至蛋白浓度0.3mg/ml后，采用10ml西林瓶进行除菌灌装、冻干、轧盖，装量均为0.3mg/支，即得到rhTNK-tPA I型或rhTNK-tPA II型冻干成品；S6、采用紫外检测法检测冻干成品的蛋白含量，SDS-PAGE法检测冻干成品中I/II型比例，LC-MS标定冻干成品的纯度，即获得rhTNK-tPA I型或rhTNK-tPA II型标准品；所述步骤S2中的平衡缓冲液A的组分为20mM PBS、0.04%聚山梨酯80，pH8.0±0.1，其用量为1.5~3.0 CV；所述步骤S2中洗脱液a由以下浓度的组分组成：10~20mM PBS，0.05~0.15M EACA氨基己酸，1~3M Urea尿素，洗脱液的pH值为8.0±0.1，用量为1.5～3.0 CV；所述步骤S2中层析柱规模为φ3.5cm×24cm；所述步骤S4中平衡缓冲液B的组分为50~60g/L精氨酸、0.02~0.06%聚山梨酯80，pH7.4±0.1；所述步骤S4中洗脱液b由以下浓度的组分组成：50~60g/L精氨酸、0.02~0.06%聚山梨酯80，pH7.4±0.1。

关 键 词：比活  层析 冻干 蛋白分离  高效处理  快速分离  检测  制备  

IPC专利分类号：C12N9/48(20060101)