文献类型：会议

作　　者：申本昌 朱蔚云 李佩琼 谢天炽

作者单位：广州医学院基础学院生物技术系

会议文献：第十二次全国医学遗传学学术会议论文集

会议名称：第十二次全国医学遗传学学术会议

会议日期：20130401

会议地点：郑州

主办单位：中华医学会;中国遗传学会

出版日期：20130400

学会名称：中国遗传学会

语　　种：中文

摘　　要：目的 探讨一种简单、快捷的不依赖于载体多克隆位点及目的序列的基因亚克隆PCR方法.方法 设计一对针对目的序列及载体序列的PCR上、下游引物,扩增目的序列的引物末端分别和载体序列有18个碱基的重叠,使用高保真的DNA聚合酶进行目的序列和载体序列的扩增,扩增产物混合后,利用DpnI消化降解目的序列及载体的PCR模板,混合物直接用于转化,挑取阳性克隆,测序证明方法的可靠性,提取阳性克隆的质粒,体外转录的mRNA纯化后注入非洲爪蟾卵,进行表达.结果 利用本方法,亚克隆了很多人的尼古丁受体(nAChR)亚基(α4,α9和β2、5-羟色胺受体3A (5-HT3A)到载体pGEMHE,人表皮细胞特异分子2基因到p3XFLAGCMV-14载体,人的Akt3v1、Akt3v2基因到pLXSN载体.pGEMHE载体含有非洲爪蟾β血红蛋白的5'及3'非翻译区,因此可以在非洲爪蟾卵中进行高效表达,利用上述方法,亚克隆的基因在非洲爪蟾卵中表达水平增加最高达200倍.结论 利用该方法进行基因的亚克隆,不需要PCR产物的胶回收,而且不需要使用针对特定多克隆位点的特异的限制性内切酶,由于本方法使用高保真的DNA聚合酶,PCR扩增仅18个循环,降低了聚合酶所引起的错误扩增所引起的突变,利用该亚克隆方法,证明可以简单、快捷地将目的DNA片段或一个基因的cDNA亚克隆入质粒或载体,具有重复性好、实用的特点,因为该方法不依赖于序列,因此可以用于DNA嵌合体(chimera)的构建、120个碱基范围内的多点突变研究.

关 键 词：基因 亚克隆 聚合酶链反应

分 类 号：S85[动物医学类] R97[药学类]