文献类型：会议

作　　者：张梅英 王立园 徐影琪 王惟 郑志红

作者单位：中国医科大学实验动物部/辽宁省转基因动物研究重点实验室,沈阳,110001

会议文献：2013‘第十一届中国北方实验动物科技年会论文集

会议名称：2013‘第十一届中国北方实验动物科技年会

会议日期：20130910

会议地点：石家庄

主办单位：中国实验动物学会;河北省医学会

出版日期：20130901

语　　种：中文

摘　　要：目的：构建pcDNA3.1/myc-his-beclin1重组表达质粒,建立beclin1稳定转染的HCT15细胞株,为在细胞水平和动物整体水进行beclin1基因与结肠癌发生分子机制研究提供基础.方法：利用小体质粒提取试剂盒制备pcDNA3.1/myc-his-beclin1质粒DNA,将pcDNA3.1/myc-his-beclin1重组表达质粒2μg采用脂质体介导的方法转染HCT15细胞,选用600μg/ml G418进行压力筛选,2周后挑取克隆细胞株进行DNA水平的PCR初步筛查,PCR扩增阳性细胞株进行扩大培养,并选用Realtime PCR和Western Blot实验筛选高表达阳性克隆细胞株,对高表达阳性克隆细胞株采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行细胞活力与细胞凋亡检测.结果：pcDNA3.1/myc-his-beclin1重组质粒转染HCT15细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得3个阳性细胞克隆,Western Blot检测结果表明beclin 1和His蛋白标签蛋白克隆细胞条带灰度值均明显高于正常HCT15对照细胞.Realtime PCR结果显示beclin1基因转录水平克隆细胞株高于正常HCT15对照细胞,实验结果均证明外源beclin1基因稳定表达,MTT实验结果初步证明转染beclin1基因的HCT15阳性细胞组细胞增殖速率低于HCT15正常细胞组(p＜0.05),AnnexinV-FITC实验结果证明beclin1基因的HCT15阳性细胞组细胞凋亡高于HCT15正常细胞组(p＜0.05)结论：成功构建pcDNA3.1/myc-His-beclin1重组表达质载体,成功筛选出稳定高表达beclin1的HCT15细胞株.实验结果比较Beclin1基因转染细胞增值速率低于正常HCT15细胞,克隆组细胞凋亡率高于正常HCT15细胞.

关 键 词：BECLIN1 HCT15细胞  结肠癌

分 类 号：R28[中药学类;中医学类] J0-[艺术学理论类]