文献类型：期刊文章

作　　者：张士军[1] 常恒祯[1] 王路鹿[1] 翟菲菲[1] 鞠丹迪[1] 胡盼[1] 卢士英[1] 李岩松[1] 周玉[1] 柳增善[1] 李兆辉[1] 任洪林[1]

ZHANG Shi-jun;CHANG Heng-zhen;WNANG Lu-lu;ZHAI Fei-fei;JU Dan-di;HU Pan;LU Shi-ying;LI Yan-song;ZHOU Yu;LIU Zeng-shan;LI Zhao-hui;REN Hong-lin(Institute of Zoonosis/Key Laboratoty of Zoonosis Research,Ministry of Education,College of Veterianry Medicine,Jilin University,Changchun 130062,China)

机构地区：[1]吉林大学人兽共患病研究所/人兽共患病研究教育部重点实验室/动物医学学院,吉林长春130062

出　　处：《中国预防兽医学报》

基　　金：国家重点研发计划资助(2018YFD0500900);吉林省科技发展计划项目(20170101149JC)

年　　份：2020

卷　　号：42

期　　号：4

起止页码：352-359

语　　种：中文

收录情况：BDHX、BDHX2017、CAB、CAS、CSCD、CSCD_E2019_2020、IC、JST、RCCSE、WOS、ZGKJHX、核心刊

摘　　要：为简便、快速测定宿主体内或细胞内布鲁氏菌的活菌数,本研究以布鲁氏菌单拷贝bcsp31基因为检测靶标,设计特异性引物,经优化反应条件及叠氮溴化丙锭(PMA)最佳使用浓度与曝光时间,建立了一种测定布鲁氏菌活菌数的叠氮溴化丙锭--荧光定量PCR方法(PMA-qPCR),并评估了该方法的特异性、敏感性、重复性。结果显示,建立的qPCR标准曲线Ct值与质粒标准品拷贝数对数值之间线性关系良好;特异性试验结果显示,该方法对布鲁氏菌S2株扩增结果为阳性,对大肠杆菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶氏菌、副溶血弧菌扩增结果均为阴性;其对布鲁氏菌S2的检测限为10~3cfu/mL,比常规PCR方法敏感性高100倍;重复性试验结果显示,批间及批内重复试验的变异系数均为0.63%~2.04%,重复性好。利用该方法对不同比例布鲁氏菌S2活菌/死菌混合样品定量测定,结果显示随活菌比例的增大,测得的活菌数与常规qPCR测定值越接近,表明经优化处理的PMA有效抑制了qPCR对死菌DNA的扩增,但对活菌的qPCR扩增无影响。将该方法与平板计数法共同测定TSB纯培养的布鲁氏菌S2活菌数,结果二者的测定值无统计学差异。随后利用这两种方法同时测定两种不同浓度的S2侵染巨噬细胞后的胞内活菌数,结果显示两种方法测定值虽然均差异显著(p<0.05),但测得的活菌数均在一个数量级且变化趋势一致,并均与侵染的活菌数呈正相关。上述结果表明,本研究建立的PMA-qPCR检测方法可以对布鲁氏菌活菌实现快速定量检测,为布鲁氏菌活菌数测定相关研究提供可行技术。

关 键 词：布鲁氏菌 bcsp31  叠氮溴化丙锭(PMA)  荧光定量PCR  标准曲线  

分 类 号：S852.61]